卡格列净经由密二糖以微生物群依赖的方式缓解糖尿病肾小球内皮损伤

《Advanced Science》：Canagliflozin Alleviates Diabetic Glomerular Endothelial Injury via Melibiose in a Microbiota-Dependent Manner

　　

卡格列净能降低糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease，DKD）患者的蛋白尿，且效果独立于其降糖作用，但其机制尚不清楚。研究人员分析了85例接受卡格列净治疗的患者和85例对照患者在26周内的情况，以探究肠道微生物群及其代谢物是否参与肾脏保护作用。卡格列净重塑了肠道微生物群，尤其显著富集了肠道罗斯氏菌（Roseburia intestinalis）并增加了血浆密二糖（melibiose）水平。在小鼠模型中，卡格列净缓解了肾小球内皮损伤和蛋白尿。通过粪便微生物群移植（Fecal Microbiota Transplantation，FMT）、灌胃肠道罗斯氏菌或补充密二糖，可以复制类似的保护效应。从机制上看，密二糖与乙二醛酶1（glyoxalase 1，GLO1）结合并激活该酶，降低了甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）水平，从而抑制了晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（Advanced Glycation End products-Receptor for AGEs，AGE-RAGE）通路，维持了肾小球内皮完整性。此外，口服密二糖前体物质可降低早期DKD患者的蛋白尿。这些发现表明，肠道-肾脏轴参与了卡格列净的肾脏保护作用，并提示密二糖可能成为DKD的潜在治疗策略。

糖尿病肾病（DKD）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是全球终末期肾病的主要病因。持续性蛋白尿是DKD的标志，反映了肾小球滤过屏障的结构和功能损伤。其中，肾小球内皮损伤被认为是DKD发病机制中的早期和关键事件，可导致通透性增加和蛋白尿的发生。尽管传统治疗取得了进展，但DKD进展的残余风险仍然存在，这突显了针对早期肾小球内皮功能障碍的新型治疗策略的必要性。钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂（sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor，SGLT2i）卡格列净在DKD患者中展现出强大的肾脏保护作用，能显著减少蛋白尿并延缓肾功能下降。有趣的是，除了经典的抑制肾脏葡萄糖重吸收作用外，卡格列净还被证明可以调节肠道葡萄糖代谢并重塑肠道微生物组成，从而影响宿主的碳水化合物代谢。这种相互作用提示肠道-肾脏轴在介导卡格列净治疗获益中可能发挥作用。肠道微生物群已成为DKD病理生理学的关键贡献者，其产生的多种代谢物进入体循环，直接影响肾脏细胞功能。由于肾小球内皮与血液持续接触，它成为感知和响应肠道来源代谢物的关键界面。在肠道微生物群产生的多种代谢物中，碳水化合物类化合物构成了主要的一类生物活性分子，在宿主-微生物串扰中发挥着不可或缺的作用。密二糖（melibiose）是一种微生物来源的二糖，近年来因其潜在的有益作用（包括抗炎和抗氧化特性，以及其益生元功能）而备受关注。然而，密二糖和其他微生物来源的碳水化合物在肾小球内皮功能和DKD中的作用在很大程度上仍未被探索。本研究旨在探讨卡格列净对DKD患者和小鼠模型肠道微生物组和代谢组的调节作用，评估微生物代谢物对肾小球内皮损伤的保护作用，并确定潜在的分子靶点。通过揭示介导卡格列净抗蛋白尿效应的肠道-肾脏轴交叉对话，这项工作为靶向DKD治疗提供了新的见解。

在研究结果部分，首先，研究人员建立了多中心队列，纳入接受卡格列净治疗的患者和未接受SGLT2i治疗的对照组。尽管基线糖化血红蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）相似，但卡格列净治疗26周后显著降低了尿白蛋白肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio，UACR）。16S rRNA测序显示，卡格列净组的Simpson指数（均匀度）更高，微生物群落结构明显不同。线性判别分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）识别出多个丰度显著不同的菌属，其中罗斯氏菌属的丰度与肾脏指标（特别是UACR）呈强负相关。其次，在DKD小鼠模型中，卡格列净治疗同样改善了肾功能、蛋白尿和肾小球病理损伤。透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）和扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）显示，卡格列净恢复了肾小球内皮窗孔结构，并上调了紧密连接蛋白（如ZO-1、OCLN）和糖萼核心蛋白（SDC1）的表达，下调了损伤标志物（如ET-1、ICAM-1）。肠道微生物群分析表明，卡格列净治疗增加了小鼠肠道中罗斯氏菌等有益菌的丰度，且该丰度与UACR呈负相关。接下来，研究人员通过使用抗生素耗竭肠道菌群，发现这显著削弱了卡格列净降低UACR和改善肾小球内皮损伤的效果。通过粪便微生物群移植（FMT）实验进一步验证，将来自卡格列净治疗供体小鼠的肠道菌群移植到抗生素预处理的受体DKD小鼠中，成功复制了改善肾功能和肾小球内皮损伤的效应。然后，研究聚焦于关键菌种。通过定量PCR和分析确认，卡格列净特异性地增加了肠道中的肠道罗斯氏菌（R. intestinalis），其丰度与UACR强负相关。给DKD小鼠口服活的肠道罗斯氏菌（而非热灭活菌），成功定植于肠道，并显著降低了蛋白尿、血肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），改善了肾小球内皮损伤，而热灭活菌无此效果。进一步，研究人员通过广泛靶向代谢组学分析，发现卡格列净治疗显著提高了患者和小鼠血浆中微生物代谢物密二糖的水平，且该水平与UACR和肠道罗斯氏菌丰度显著相关。密二糖水平的升高依赖于肠道菌群的存在。体外培养证实，肠道罗斯氏菌能产生密二糖，其基因组中富集的β-果糖苷酶（β-fructosidase）是关键酶。口服密二糖可剂量依赖性地减轻DKD小鼠的蛋白尿，改善肾功能，并恢复肾小球内皮结构和功能，效果与卡格列净类似。为阐明机制，研究人员对密二糖处理的人肾小球内皮细胞（human glomerular endothelial cells，HGECs）进行转录组测序，发现AGE-RAGE信号通路富集显著降低。药物亲和响应靶点稳定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）实验结合质谱鉴定，并利用细胞热转变分析（cellular thermal shift assay，CETSA）和微量热泳动（microscale thermophoresis，MST）证实，密二糖能直接结合并激活GLO1蛋白，解离常数（Kd）为3.48 μM。在高糖条件下，密二糖显著增强了GLO1的酶活性，降低了HGECs和糖尿病小鼠肾脏中的MGO水平。过表达GLO1可模拟密二糖的保护作用，而敲低GLO1则加剧内皮损伤并抵消密二糖的保护效应。分子对接预测了密二糖与GLO1的结合位点（R38，N104等），并通过点突变实验验证了这些残基的重要性。在体内，利用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）在肾小球内皮细胞中特异性过表达GLO1可减轻糖尿病肾小球内皮损伤；而构建内皮细胞特异性GLO1敲除（GLO1^-/-）小鼠发现，GLO1缺失加剧了糖尿病肾小球内皮损伤，并且密二糖在GLO1^-/-小鼠中失去了保护作用。最后，开展了一项为期12周的先导性临床研究。由于食品级密二糖不可得，研究使用其FDA认可的、一般认为安全（Generally Recognized As Safe，GRAS）的前体物质水苏糖（stachyose）进行膳食补充。19名早期DKD患者（基线UACR在30-1000 mg/g^-1）完成研究，口服水苏糖显著提高了血浆密二糖水平，并降低了UACR、循环MGO、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）水平。

综合讨论部分总结指出，本研究系统揭示了卡格列净通过调节肠道微生物群及其代谢物介导肾脏保护的新机制。研究发现，卡格列净在DKD患者中显著重塑了肠道微生物组成，特别是增加了与肾功能改善密切相关的肠道罗斯氏菌丰度。通过一系列临床和动物实验，研究人员确立了“卡格列净-肠道罗斯氏菌-密二糖-GLO1”这一轴线在保护肾小球内皮中的核心作用。密二糖作为一种关键代谢物，通过直接结合并激活GLO1，降低其底物MGO的水平，从而间接抑制AGE-RAGE信号通路，减轻内皮炎症和损伤。这项研究不仅为SGLT2抑制剂的“非降糖依赖性”肾脏保护效应提供了新的解释，也凸显了靶向肠道-肾脏轴的治疗潜力。先导性临床试验使用密二糖前体水苏糖观察到蛋白尿改善，为后续临床转化提供了重要依据。研究结论部分明确指出：通过整体性研究，本研究揭示了卡格列净调节的肠道微生物群在DKD干预中所起的关键作用。值得注意的是，肠道罗斯氏菌衍生的密二糖增加了其蛋白靶点GLO1的活性，从而抑制AGE-RAGE信号通路，缓解肾小球内皮损伤，最终减少DKD患者的蛋白尿。更重要的是，研究进一步证实了口服密二糖前体物质也具有治疗早期DKD患者蛋白尿的潜力，这突显了本研究的临床转化价值。总之，这些发现加深了研究人员对DKD中肠道-肾脏轴的理解，并为临床实践中减轻蛋白尿提供了新的潜在治疗途径。