AppNL-G-F阿尔茨海默病模型海马区早期区域性小胶质细胞(Microglia)重构

《Neuropathology and Applied Neurobiology》：Early Regional Microglial Remodelling in the Hippocampus of the AppNL-G-F Alzheimer's Model

　　

目的：小胶质细胞(Microglia)在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)过程中发生深刻的结构与功能改变，但在淀粉样蛋白沉积之前发生的最早阶段形态重构尚不清楚。研究人员假设AppNL-G-F小鼠海马区小胶质细胞在局部斑块形成前即出现早期、区域特异性的结构适应，反映疾病相关结构性重构的初始阶段。方法：选用2月龄AppNL-G-F及野生型(Wildtype, WT)小鼠，采用Iba1标记的高分辨率共聚焦显微镜观察背侧CA1区顶树突野小胶质细胞，利用Imaris软件进行自动化三维重建，通过定量形态计量学分析细胞密度、Iba1覆盖度、突起拓扑结构及基于Sholl分析的树突复杂度，所有统计分析采用以性别为固定因子的线性混合效应模型。结果：此年龄下AppNL-G-F小鼠小胶质细胞密度及总Iba1覆盖度无变化，而Sholl分析显示突起交叉点数及总突起长度显著减少，单个细胞领土覆盖缩小，表明监视性突起网在细胞数目不变情况下发生早期收缩。结论：上述发现证明AppNL-G-F小鼠海马小胶质细胞在局部淀粉样沉积明显可见之前经历协调性早期结构重构，界定了AD致病过程中神经免疫参与相关的最早期结构性适应。

本文对发表于《Neuropathology and Applied Neurobiology》的研究论文"Early Regional Microglial Remodelling in the Hippocampus of the App^NL-G-FAlzheimer's Model"进行解读总结。

【研究背景与立项依据】

小胶质细胞(Microglia，脑内组织驻留巨噬细胞)通过精细突起的持续伸缩对脑实质进行动态监视，其形态整合了转录、代谢及微环境因素，被视为细胞功能状态的structural correlate(结构相关性指标)而非活化状态的二元标志。在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)晚期，小胶质细胞围绕纤维状Aβ斑块转变为阿米巴样、吞噬表型，即疾病相关小胶质细胞(disease?associated microglia, DAM)或活化反应小胶质细胞(activated response microglia, ARM)。然而在斑块出现前的preplaque期——此时可溶性Aβ寡聚体升高、神经元应激初现——小胶质细胞是否已发生可检测的形态学重构仍不明确。既往多数转基因AD模型存在App过表达带来的人为效应，且preplaque海马区的区域性早期形态变化缺乏高分辨率三维量化证据。因此，研究人员利用生理表达水平携带三个家族性AD突变(Swedish KM670/671NL、Iberian I716F、Arctic E693G)的App^NL-G-F基因敲入小鼠，在其2月龄海马CA1区尚未出现局部淀粉样斑块时，通过高分辨率三维形态计量学检测背侧CA1顶树突野小胶质细胞是否发生区域特异性早期结构重构，以明确AD致病过程中最早的小胶质细胞结构性适应。

【主要技术方法】

研究人员选用2月龄App^{NL-G-F/NL-G-F}纯合子小鼠(雌雄各4只)与同背景野生型C57BL/6J小鼠(雌雄各5只，共n=18)，经心灌注固定后取脑制作50 μm厚自由浮切片，以抗Iba1(离子钙结合适配分子1, ionized calcium?binding adapter molecule 1)一抗及Alexa Fluor 647二抗进行免疫荧光染色，并以X34荧光染料标记β?折叠结构蛋白检测淀粉样斑块。采用Leica SP8 Lightning共聚焦显微镜采集背侧海马CA1顶树突野25 μm Z?stack图像，使用Imaris(v10.0.1)软件进行Z轴衰减校正、CA1区域手动圈定、Iba1⁺细胞体Spot检测、Iba1覆盖Surface分析、单细胞三维Filament Tracer自动突起重建及Convex Hull(凸包)单细胞膜领土域计算，Sholl分析以距胞体1 μm递增径向环计算突起交叉点，统计学采用含基因型与性别为固定因子、小鼠个体为随机截距的线性混合效应模型(linear mixed?effects models, LMMs)，Sholl剖面重复测量半径也纳入模型。

【研究结果】

■ 3.1 Microglial Number and Iba1?Defined Coverage Remain Stable at the Preplaque Stage

通过计数Iba1⁺细胞密度及计算Iba1免疫阳性覆盖面积占CA1顶树突野比例，发现2月龄App^NL-G-F与WT小鼠间小胶质细胞密度及Iba1覆盖度均无显著差异(p>0.05)，且无性别主效应。表明在局部淀粉样斑块尚未沉积时，海马CA1区小胶质细胞种群数量和群体实质占有率维持不变。

■ 3.2 Early Simplification of Microglial Arbor Complexity

对999个单细胞(WT=609, App^NL-G-F=390)进行三维突起重建与Sholl分析，LMM显示App基因型主效应(p<0.0001)及App基因型×半径交互效应(p<0.0001)显著，App^NL-G-F小胶质细胞Sholl交叉点曲线整体下移，在距胞体较远距离处突起交叉显著减少。按性别分层后基因型依赖的突起简化仍存在。结果表明App^NL-G-F小鼠海马CA1小胶质细胞在斑块形成前即出现距离依赖性的突起分支复杂度降低(arbor simplification)。

■ 3.3 Microglial Morphological Indices

在Sholl分析基础上提取单细胞形态参数：App^NL-G-F组总Sholl交叉点面积(AUC, p=0.0055)、总突起长度(p=0.0085)及Convex Hull体积即单细胞膜领土覆盖域(p=0.0002)均显著低于WT，分支点数目无显著差异(p=0.2354)。主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)显示PC1以突起交叉、突起长度及领土覆盖为主载荷，两基因型在PC1方向呈分离趋势。结果说明观察到的变化源于突起网收缩(contraction of surveillance arbor)伴单细胞膜监视领土缩小，而非细胞丢失或单纯分支点数减少，是单个细胞突起架构的有序重组。

【讨论与结论翻译】

讨论部分指出，本研究发现的preplaque期小胶质细胞突起架构协调收缩与领土缩小，是在细胞密度和Iba1覆盖度保存的前提下发生的，定义了一个区别于后期 plaque?associated DAM/ARM 表型的初始结构性适应阶段，可能由可溶性Aβ寡聚体、神经元活动改变或早期代谢应激通过嘌呤能及TREM2(Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells 2)依赖通路调控肌动蛋白重组所致；此收缩形态或与弥散Aβ物种的早期相互作用相容，属向淀粉样蛋白响应态过渡的形态学表现。研究局限包括20×物镜对最细末端丝状伪足分辨有限、Iba1可能低估最细突起及Filament Tracer算法不可避免的微量追踪误差。

结论(原文翻译)：

综上所述，本研究确定了App^NL-G-F小鼠海马区内一种斑块前的早期小胶质细胞结构性重构阶段。所观察到的突起复杂度及监视领土的收缩在未伴随细胞密度变化的情况下发生，符合小胶质细胞架构的协调性重组，可能代表了对淀粉样蛋白生成性应激的早期适应性反应。这些发现拓展了当前的AD致病模型，凸显出一个衔接稳态监视与斑块相关活化之间的过渡性形态学状态，并为探究小胶质细胞对淀粉样蛋白生成性应激的最早期反应提供了一个可操作的在体研究框架。