《New Plant Protection》：A genome-integrated CRISPR/Cas12a system enables efficient genetic engineering in Xenorhabdus budapestensis XBD8
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Xenorhabdus budapestensis菌株XBD8，分离自中国东北的土壤，能产生多种具有农业应用前景的天然产物，包括fabclavines和GameXPeptides。然而，该菌株的开发和应用受到严重限制，因为传统的基因组编辑方法依赖于同源重组技术
Xenorhabdus budapestensis菌株XBD8，分离自中国东北的土壤，能产生多种具有农业应用前景的天然产物，包括fabclavines和GameXPeptides。然而，该菌株的开发和应用受到严重限制，因为传统的基因组编辑方法依赖于同源重组技术，效率低下且耗时。CRISPR/Cas技术源自原核生物的适应性免疫系统，为微生物基因组编辑提供了强大且开创性的工具。本研究中，研究人员开发了一种基于CRISPR/Cas12a的XBD8基因组编辑方法，能够精确且无缝地删除或替换长度为379至45,168个碱基对的DNA片段，成功率超过90%。利用该系统，研究人员将群体感应（QS）调控模块LuxR/LuxI引入XBD8，实现了对参与fabclavines生物合成的关键生物合成基因的动态调控。结果，fabclavine-8的产量达到140.10 mg/L，与野生型菌株相比提高了1.90倍。
论文解读：
Xenorhabdus属细菌是一类革兰氏阴性杆状菌，与斯氏线虫属（Steinnernema）昆虫病原线虫形成专性互利共生关系。其生命周期包括共生期和致病期。在致病期，Xenorhabdus分泌多种毒素和酶杀死宿主昆虫，并将其转化为富含营养的环境以利于线虫繁殖。Xenorhabdus budapestensis作为该属的代表性物种，能产生多种次级代谢产物，如fabclavines、rhabdopeptides和GameXPeptides，这些产物大多通过非核糖体肽合成酶（NRPS）途径合成，并具有抗生素、杀虫和杀线虫活性。其中，fabclavines是一类肽-聚酮-聚胺杂合天然产物，具有广谱抗微生物活性。研究人员之前从本实验室分离的XBD8菌株的无细胞培养上清液中鉴定了fabclavine-8（Fcl-8），它对包括稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和链格孢菌（Alternaria solani）在内的主要植物病原体表现出强效且广谱的活性，突显了其在农业病害防治中的巨大潜力。为促进Fcl-8的实际应用，亟需对XBD8进行遗传工程改造以提高产量并降低生产成本，这凸显了对高效且便捷的遗传操作方法的迫切需求。传统的“两步选择/反选择”基因编辑策略虽然提高了效率，但整个工作流程仍需约14天。CRISPR/Cas系统作为一种强大的基因编辑工具，已成功应用于多种微生物。相较于广泛使用的SpCas9，来源于弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）的Cas12a蛋白具有分子量更小、能直接加工pre-crRNA、不需要宿主核糖核酸酶或tracrRNA等优点，因此对宿主细胞的代谢负担更低。λ-Red重组系统常与CRISPR/Cas系统联用以提高编辑效率。
本研究中，研究人员为XBD8开发了一种基于CRISPR/Cas12a的基因组编辑方法，实现了精确且无缝的基因修饰。该方法将Cas12a和λ-Red重组系统整合到宿主菌株的基因组中，使得供体质粒相对较小（约6 kb）且易于构建。该编辑系统的整个周期缩短至7天。利用这一高效策略，研究人员成功地将基于LuxR/LuxI的群体感应系统引入XBD8，实现了对Fcl-8生产中关键生物合成基因fclC和gene2204的动态调控。工程菌株的Fcl-8产量比野生型菌株提高了1.90倍，最终效价达到140.10 mg/L，且未损害细菌生长。这项工作为XBD8提供了一个可扩展的遗传工程框架，并为提高Xenorhabdus属多种天然产物的产量提供了一种通用策略。该研究发表在《New Plant Protection》期刊。
为开展本研究，研究人员主要采用了以下几个关键技术方法：首先，利用同源重组方法构建了整合有PBAD-Cas12a和Pvan-λ-Red表达盒的底盘菌株CR2。其次，构建了包含crRNA表达盒和同源修复模板的小型供体质粒（约6 kb），并通过接合转移将其导入底盘菌株。最后，通过点板实验评估了编辑系统的细胞毒性和DNA修复效率，并通过菌落PCR和Sanger测序验证了编辑效率。研究中的所有实验菌株均分离或构建自实验室保存的X. budapestensis XBD8野生型菌株。
3.1 CRISPR/Cas12a基因组编辑系统的构建与评估
为了构建高效的CRISPR/Cas12a基因编辑系统，研究人员首先评估了XBD8内源DNA修复途径的功能。他们构建了携带染色体整合的PBAD-Cas12a表达盒的菌株CR1。实验结果表明，仅诱导Cas12a表达而没有外源修复系统时，菌株无法存活，说明XBD8的内源同源重组不足以修复Cas12a诱导的双链断裂（DSB）。为了提高同源定向修复（HDR）效率，研究人员在CR1背景中整合了一个3.3 kb的Pvan-λ-Red盒，生成了工程菌株CR2。随后，通过引入一个约6 kb的小型供体质粒（包含两个反向的crRNA表达盒、约500 bp同源臂的修复模板和用于反选择的sacB基因）实现了遗传修饰。点板实验评估显示，该CRISPR/Cas12a基因编辑系统在XBD8中功能正常。
3.2 CRISPR/Cas12a基因组编辑系统的效率评估
研究人员系统评估了该系统在XBD8中的编辑性能。通过靶向不同长度的基因组片段，他们测试了基因敲除效率。对于短DNA片段（如gene1964和gene2422-2426），成功率分别达到95.6%和100%。对于较长的基因簇（如14.5 kb的NRPS基因簇genes2100-2102和13.4 kb的鞭毛合成相关基因簇genes2363-2379），敲除效率也高达95.6%。对于更大的47.79 kb的fabclavines合成基因簇（fclC-fclN），敲除效率仍保持95.6%的高水平。此外，评估基因替换效率的实验也取得了成功：将gene3678替换为gfp基因的成功率为100%，将fclC的启动子替换为组成型启动子Pro1的成功率也为100%。对同一基因组位点进行多次启动子替换实验也获得了95.6%至100%的高成功率。这些结果证实了该基因组编辑方法的高效性和可靠性。
3.3 集成LuxR/LuxI群体感应系统提高Fcl-8产量
LuxI/LuxR系统是一种经典的群体感应系统。研究人员首先在XBD8中利用mCherry荧光蛋白作为报告基因对其进行了表征，发现该系统能显著激活PluxI启动子。接着，他们设计了包含“积累模块”和“激活模块”的LuxI/LuxR系统，并利用CRISPR/Cas12a基因组编辑系统，将这两个功能模块依次整合到三个指定的基因组位点：fclC的启动子区域、gene2204的启动子区域以及genes2100-2102位点。具体地，将fclC的天然启动子替换为“激活模块”，将gene2204的启动子替换为PluxI启动子，从而实现了对Fcl-8生物合成关键基因fclC和gene2204的动态调控。随后，将非必需的NRPS基因genes2100-2102替换为“积累模块”以增强AHL群体感应信号的产生。这些改造成功构建了菌株CRM14和CRM15，所有基因编辑实验均达到100%的成功率。菌株CRM14和CRM15的生长曲线与野生型菌株无显著差异。发酵实验表明，CRM14和CRM15的Fcl-8产量分别达到140.10 mg/L和131.23 mg/L，较野生型菌株（73.91 mg/L）分别提高了1.90倍和1.78倍。同时，Fcl-8的前体物质聚胺的合成水平也显著提高。这些发现证明，通过LuxI/LuxR介导的动态调控能显著提高Fcl-8产量，且不影响细胞生长。
讨论部分总结如下：Fabclavines是一类结构独特的肽-聚酮-聚胺杂合天然产物，具有广谱活性，但Fcl-8在野生菌株中产量低，传统基因编辑方法效率不高。当前CRISPR编辑系统（双质粒或单质粒）各有局限。本研究开发的基因组整合/小型供体质粒CRISPR/Cas12a系统，其Cas12a和λ-Red系统均整合于宿主染色体，供体质粒小（~6 kb）易构建。该系统编辑效率高（>90%），工作流程简化，周期缩短至7天。静态调控策略常导致生长抑制和代谢失衡，而群体感应系统能动态调节代谢流。研究人员利用本系统将LuxR/LuxI群体感应系统整合到XBD8中，实现了对fclC和gene2204的动态调控，在不损害细菌生长的前提下显著提高了Fcl-8产量。该研究为XBD8提供了可靠的遗传工具，并为增强Xenorhabdus属天然产物生产提供了通用策略。聚胺前体的积累提示下游生物合成基因表达可能不足，未来可通过增强其表达或优化培养基来进一步提高产量。
研究结论部分翻译如下：总之，本研究开发了一种基于基因组整合/小型供体质粒的CRISPR/Cas12a系统，该系统能够快速、高效地编辑XBD8的基因组片段，为进一步研究该菌株的功能基因组学和代谢工程提供了强大的遗传工具。利用该平台，研究人员将LuxR/LuxI群体感应系统整合到XBD8中，实现了对关键生物合成基因fclC和2204的动态调控，从而在不损害细菌生长的前提下显著增强了Fcl-8的产量。这项工作为XBD8提供了一个可扩展的遗传工程框架，并为提高Xenorhabdus属多种天然产物的产量提供了一种通用策略。
