《Journal of Virology》：Rethinking residual p53 function in HPV-positive cervical cancer cells
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人乳头瘤病毒（HPV）驱动的癌症仍是全球最普遍的癌症之一。HPV E7蛋白在受感染细胞中诱导非程序性的细胞DNA复制；这种复制所产生的凋亡信号被高危型HPV E6癌蛋白所抵消，E6蛋白通过靶向多种细胞蛋白进行泛素-蛋白酶体介导的降解（UPS）来促进细胞增殖，其
人乳头瘤病毒（HPV）驱动的癌症仍是全球最普遍的癌症之一。HPV E7蛋白在受感染细胞中诱导非程序性的细胞DNA复制；这种复制所产生的凋亡信号被高危型HPV E6癌蛋白所抵消，E6蛋白通过靶向多种细胞蛋白进行泛素-蛋白酶体介导的降解（UPS）来促进细胞增殖，其中包括p53凋亡肿瘤抑制蛋白。E6癌蛋白与泛素连接酶E6AP形成异源二聚体复合物，募集并降解p53，从而抑制促凋亡细胞信号并破坏细胞周期进程，导致肿瘤细胞生长增加。此外，E6癌蛋白结合p53，抑制其转录反式激活功能，并破坏p21-Waf1-Cip1通路的激活。然而，已有报道在HPV阳性细胞系中检测到残余的p53活性，这表明p53在HPV阳性宫颈癌细胞中可能具有获得性功能（gain-of-function, GOF）作用。为研究此问题，研究人员利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物构建了HPV阳性p53敲除（KO）HeLa细胞系。研究观察到，p53 KO细胞的生长和代谢活性严重受损。对这些细胞的转录组学分析揭示了p53的GOF活性以及野生型p53通路的富集。免疫沉淀分析证实了这些转化细胞中存在GOF p53池。本研究因此重新强调了残余p53作用的问题，并为研究其在HPV阳性宫颈癌细胞中的功能机制提供了一个模型系统。
宫颈癌是全球女性第四大常见癌症，估计每年新增病例约66万例，也是导致癌症死亡的主要原因之一，2022年全球约有35万例死亡。人乳头瘤病毒（HPV）的关键降解靶点之一是p53肿瘤抑制蛋白；然而，在HPV阳性细胞中仍可检测到该蛋白的残余量。本研究中，研究人员构建了p53敲除细胞系，以确定残余p53是否具有任何促进生长的获得性功能活性。研究结果表明，缺失p53的细胞生长更慢，这表明残余p53具有肿瘤促进功能，且当与E6形成复合物时，其构象类似于突变型p53，揭示了HPV颠覆p53功能的替代机制。
HPV感染是宫颈癌的主要病因，超过99%的宫颈癌病例与持续性高危型HPV感染相关。HPV的两个主要癌蛋白E6和E7在病毒致癌过程中起核心作用。E7通过结合并抑制视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）来驱动细胞周期进程，导致异常的DNA复制。作为应对，细胞通常会激活p53依赖的凋亡或衰老程序。为了克服这一防御机制，高危型HPV E6蛋白与细胞E3泛素连接酶UBE3A/E6AP形成复合物，靶向p53进行UPS降解，从而抑制凋亡并促进细胞存活与增殖。然而，多项研究发现在HPV阳性细胞中p53并未被完全降解，而是维持着一个可检测的“残余”水平。这些残余p53的功能长期以来存在争议，传统观点认为其主要被E6功能失活，但一些证据提示其可能具有非经典的、甚至类似突变型p53的GOF活性。因此，明确残余p53在HPV阳性宫颈癌细胞中的确切功能，对于深入理解HPV致癌机制具有重要意义。本研究利用基因编辑技术精确敲除残余p53，系统性地探究了其对HPV阳性宫颈癌细胞恶性表型的影响。
为深入解析残余p53的功能，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物系统，在HPV18阳性的HeLa细胞系中对p53基因（外显子4）进行靶向敲除，并通过蛋白质免疫印迹（Western blot）和Sanger测序筛选与验证获得完全缺失p53蛋白的稳定细胞克隆。其次，对p53敲除（KO）克隆和野生型（WT）对照细胞进行了RNA测序（RNA-seq），并通过生物信息学方法进行差异表达基因分析、基因本体论（GO）和KEGG通路富集分析。最后，通过细胞增殖、XTT代谢活性、集落形成、Matrigel侵袭和软琼脂克隆形成等多种细胞功能实验，系统评估了p53缺失对细胞表型的影响，并通过免疫沉淀（Co-IP）和蛋白质免疫印迹分析了p53与E6/E6AP复合物的相互作用及其构象变化。
研究背景与模型建立：本研究首先验证了在HPV阳性细胞系（包括CaSki、SiHa、C41和HeLa）中，即使经蛋白酶体抑制剂（MG132）处理，仍可检测到残余的p53蛋白，提示存在精确的调控平衡。研究人员采用CRISPR-Cas9 RNP复合物靶向p53基因，经过严格筛选（包括MG132处理以挽救任何潜在的p53片段），获得了两个完全缺失p53蛋白的稳定KO细胞克隆（A和B）。序列分析证实，这些克隆在p53基因的外显子4发生了移码突变，导致提前产生终止密码子。为排除实验操作的影响，研究人员同时选择了一个经历相同筛选过程但仍表达p53的克隆（D）作为额外对照。
p53敲除对细胞生长与代谢的影响：功能实验表明，与HeLa WT和对照克隆D相比，p53 KO细胞的增殖速率显著降低（增殖实验），代谢活性（XTT实验）和集落形成能力（集落形成实验）也严重受损。这表明，在HPV阳性细胞背景下，完全丧失p53功能对细胞生存是不利的，与“p53作为肿瘤抑制因子，其缺失应促进生长”的传统预期相反。研究人员进一步确认，p53的敲除并未影响E6蛋白水平或E6AP介导的E6稳定性（通过siRNA敲低E6AP实验验证），排除了表型差异由E6/E6AP轴变化引起的可能性。
转录组学分析揭示功能通路改变：对p53 KO细胞进行的RNA-seq分析发现了1310个差异表达基因。GO富集分析显示，在p53缺失的细胞中，上调基因主要与细胞粘附、炎症反应和整合素结合相关；而下调基因则富集于细胞外基质（ECM）组织、细胞迁移和增殖等生物学过程。KEGG通路分析进一步揭示，上调通路包括细胞因子-受体相互作用等炎症相关通路，而下调通路则包括ECM-受体相互作用、粘着斑以及Hippo信号通路。这些结果表明，p53缺失扰乱了细胞稳态，特别是与细胞表面蛋白和ECM相关的通路。
p53获得性功能靶基因的验证：为解释p53 KO细胞增殖受损的表型，研究人员将差异基因与已知的GOF突变型p53靶基因进行比较分析。结果显示，多个关键的GOF p53靶基因在p53 KO细胞中显著下调，包括原癌基因MYC、端粒酶逆转录酶TERT、甲羟戊酸途径相关基因SREBF1（编码SREBP1）和SQLE，以及紧密连接蛋白TJP1（编码ZO-1）。通过蛋白质免疫印迹和定量PCR实验，研究人员验证了这些靶蛋白和mRNA在p53 KO细胞中的表达水平确实降低。这强烈提示，残余p53可能以类似GOF突变型p53的方式，正向调控这些促进细胞增殖、存活和恶性转化的基因和通路。
p53敲除导致侵袭能力丧失：与转录组分析中ECM和粘附相关通路改变的结果一致，Matrigel侵袭实验和软琼脂实验显示，p53 KO细胞完全丧失了侵袭基质胶和在非贴壁条件下形成克隆的能力。这表明残余p53对于维持HPV阳性HeLa细胞的侵袭性和致瘤性至关重要。外源性回补p53能够恢复KO细胞的侵袭能力，但意外的是，在p53阳性细胞（克隆D和HeLa WT）中过表达p53反而抑制了侵袭性。这暗示维持HPV阳性细胞的恶性表型可能需要特定水平的p53。
残余p53的构象改变与功能：考虑到HPV阳性细胞中p53没有经典的热点突变，研究人员探索了p53构象改变的可能性。使用检测野生型p53的DO-1抗体和检测构象突变型p53的pAb240抗体进行免疫共沉淀分析，发现两种抗体都能从HeLa细胞裂解液中沉淀出E6AP蛋白，且这一过程依赖于E6的存在。这表明，与E6/E6AP复合物的相互作用可能诱导了p53的构象改变，使其暴露出类似于突变型p53的表位（如pAb240识别的表位），从而获得了促进肿瘤发生的GOF特性。
讨论与结论：综上所述，本研究利用CRISPR-Cas9介导的基因敲除模型，首次系统证明了在HPV阳性宫颈癌细胞中，残余的p53蛋白并非处于完全失活状态，而是具有重要的功能活性。其功能并非典型的肿瘤抑制，而是表现出类似GOF突变型p53的特性。敲除残余p53导致细胞增殖、代谢、集落形成和侵袭能力显著受损，表明这些残余p53对于维持HPV驱动的转化表型是必需的。转录组学和分子机制分析揭示，残余p53可能通过其构象改变（由E6/E6AP复合物诱导）来正向调控一系列GOF靶基因（如MYC、TERT、SREBP1）和相关通路（如甲羟戊酸途径、ECM相互作用），从而促进细胞生长和侵袭。这一发现颠覆了残余p53在HPV阳性细胞中仅作为降解失败的“无用”蛋白或仅具有微弱抑癌活性的传统认知，揭示了HPV癌蛋白E6与宿主抑癌蛋白p53之间更为复杂和动态的相互作用。研究强调了残余p53可能作为HPV致癌过程中的一个促癌因子，为理解HPV持续感染和宫颈癌进展提供了新视角，并提示针对残余p53或其相关通路的干预策略可能具有潜在的治疗价值。
