FabF与FadM协同回收脂肪酸并挽救金黄色葡萄球菌ΔplsX致死表型

《PLOS Genetics》：FabF and FadM cooperate to recycle fatty acids and rescue ?plsX lethality in Staphylococcus aureus

　　

磷脂是大多数细胞膜的重要组成成分。在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中，酰基转移酶PlsX被认为是启动磷脂合成的必需蛋白，除非外源脂肪酸（FA）可用于绕过该需求。研究人员报道，金黄色葡萄球菌可通过点突变FabF或FadM，在无外源脂肪酸供应的ΔplsX突变体中捕获内源性脂肪酸来源，从而克服PlsX的必需性。FabF编码脂肪酸合成（FASII）途径的3-氧代酰基-（酰基载体蛋白）合酶II，FadM编码功能尚未完全解析的双功能酰基辅酶A硫酯酶与酰基载体蛋白结合蛋白。尽管生长得到挽救，两种ΔplsX抑制突变体均表现出磷脂中脂肪酸链长缩短的特征，提示两种抑制突变均导致脂肪酸在合成过程中提前释放。此外，两种抑制突变体均对β-内酰胺类抗生素敏感性升高。两种抑制突变体的相似表型提示FabF抑制突变依赖于FadM的存在，表明FabF与FadM存在协同作用。研究人员提出，FabF抑制突变体加工效率降低，或FadM突变体中更多FadM可用于结合酰基载体蛋白，均会促进FabF-酰基-酰基载体蛋白中间体的脂肪酸释放。这种由FabF-FadM接力介导的脂肪酸释放机制可能参与维持FASII途径与磷脂合成途径之间的稳态平衡。

本研究发表于《PLOS Genetics》，针对革兰阳性病原菌金黄色葡萄球菌磷脂合成核心酶PlsX的必需性机制展开探索。已知PlsX负责将脂肪酸合成（FASII）终产物酰基-酰基载体蛋白（acyl-ACP）转化为酰基磷酸（acyl-PO₄），启动磷脂合成，传统观点认为其是细菌存活的必需蛋白，仅在外源脂肪酸存在时可被绕过。然而金黄色葡萄球菌既无替代酶PlsB，也无已知的酰基-ACP硫酯酶系统，其PlsX缺失后的代偿机制尚不明确。本研究旨在解析无外源脂肪酸条件下ΔplsX突变体的存活机制，揭示FASII与磷脂合成通路的新型调控节点。

研究人员主要采用以下关键技术方法：构建RN4220修复株（RN-R）与美国典型菌株保藏中心菌株USA300_FPR3757 JE2的ΔplsX无框缺失突变体；通过平板筛选与全基因组测序鉴定ΔplsX抑制突变体的突变位点；利用FabF特异性抑制剂平板抑菌圈实验验证FabF功能抑制的表型效应；通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合抗ACP抗体免疫印迹分析酰基-ACP积累情况；采用气相色谱法检测膜脂肪酸组成；通过噬菌体转导构建fadM::Tn插入失活突变体，验证基因互作关系；采用Etest测定最小抑菌浓度评估抗生素敏感性变化。

研究结果如下：

1. 1.
   ΔplsX无框缺失突变体的构建与验证
   研究人员成功构建了RN-R与JE2背景的ΔplsX无框缺失突变体，证实其在无外源脂肪酸的培养基中无法生长，回补野生型plsX可恢复生长，验证了PlsX的必需性。
2. 2.
   FabF点突变抑制ΔplsX的脂肪酸营养缺陷
   在无外源脂肪酸平板上筛选到31个自发抑制突变体，其中14个携带相同FabF^A119E突变（fabF1）。FabF抑制剂platensimycin在低浓度下可诱导ΔplsX突变体周围形成生长环，提示降低FabF活性可促进脂肪酸释放，弥补PlsX缺失缺陷。
3. 3.
   FadM结合口袋突变抑制ΔplsX的脂肪酸营养缺陷
   剩余17个抑制突变体均携带fadM突变，突变位点（Ile38Thr、Tyr90Phe、Tyr133Phe）均定位于FadM的酰基辅酶A结合隧道区域。fadM无义突变（fadM::Tn）无法挽救ΔplsX生长，提示FadM的部分功能而非完全失活是抑制表型所必需的。
4. 4.
   ΔplsX抑制突变体的生长特性影响
   RN-R背景的抑制突变体生长速率介于野生型与ΔplsX突变体之间，JE2背景抑制突变体生长速率与野生型相当。两种抑制突变体均表现出类胡萝卜素色素合成减少的特征。
5. 5.
   fabF与fadM抑制突变体膜脂肪酸链长缩短
   气相色谱分析显示，两种抑制突变体的膜磷脂中长链饱和脂肪酸（C18:0与C20:0）比例显著降低，短链脂肪酸比例升高，提示FASII延伸过程提前终止。
6. 6.
   ΔplsX抑制突变体对β-内酰胺类抗生素敏感性升高
   Etest结果显示，所有携带fabF或fadM抑制突变的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）对阿莫西林的最小抑菌浓度较野生型降低4-6倍，提示膜脂肪酸组成的改变可影响β-内酰胺类抗生素耐药性。
7. 7.
   JE2野生型、ΔplsX及抑制突变体的酰基-ACP种类差异
   非变性凝胶电泳免疫印迹结果显示，ΔplsX突变体积累长链酰基-ACP，而两种抑制突变体无此积累，证实其可正常将酰基-ACP转化为磷脂。
8. 8.
   ΔplsX抑制突变体无法代偿PlsX逆反应活性
   在含外源脂肪酸的培养基中添加FASII抑制剂AFN-1252后，野生型可绕过FASII抑制继续生长，而ΔplsX及抑制突变体均无法生长，提示抑制突变仅能代偿PlsX正向催化活性，无法替代其逆反应功能。
9. 9.
   FabF抑制突变的产生依赖FadM的存在
   fadM::Tn插入失活的ΔplsX突变体无法产生FabF抑制突变，也无法响应platensimycin的生长刺激效应，证实FabF与FadM在功能上存在协同依赖关系。

讨论部分总结：

研究人员提出FabF-FadM协同作用的工作模型：FabF^A119E突变或低浓度platensimycin处理会降低FabF的加工效率，阻碍丙二酰-ACP进入催化口袋，导致酰基-ACP中间体提前释放游离脂肪酸；FadM结合口袋突变降低其酰基辅酶A硫酯酶活性，使更多FadM可用于结合ACP，促进ACP从FabF催化口袋解离，进一步促进脂肪酸泄漏。释放的脂肪酸经脂肪酸激酶Fak磷酸化后进入磷脂合成通路，从而绕过PlsX的必需性。这一机制在正常生理条件下可能作为FASII与磷脂合成通路的“溢流阀”，维持两条通路的稳态平衡。值得注意的是，该代偿机制虽能挽救ΔplsX致死表型，却会导致MRSA对β-内酰胺类抗生素敏感性显著升高，为理解膜脂代谢重塑与抗生素耐药性的关联提供了新视角。