《International Journal of Food Microbiology》：Regulation of EC precursors in Huangjiu: Multi-omics deciphers the mechanism of synthetic microbial communities
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田书芳|牛恒|张玉燕|杜国成|王圆丽|李梦曦|李彦斌|刘庆涛安徽工程大学生物与食品工程学院，芜湖，241000，中国摘要乙基氨基甲酸是一种2A类致癌物，在黄酒酿造过程中会自然产生，这对提高最终产品的质量和安全性构成了重大挑战。合成微生物群落可以调节发酵过程中乙基氨基甲酸的生成，并
田书芳|牛恒|张玉燕|杜国成|王圆丽|李梦曦|李彦斌|刘庆涛
安徽工程大学生物与食品工程学院，芜湖，241000，中国
摘要
乙基氨基甲酸是一种2A类致癌物，在黄酒酿造过程中会自然产生，这对提高最终产品的质量和安全性构成了重大挑战。合成微生物群落可以调节发酵过程中乙基氨基甲酸的生成，并有效降低其含量。然而，微生物群落与乙基氨基甲酸前体生成之间的具体关系仍有待阐明。在这项研究中，我们采用了整合的宏转录组学和代谢组学分析方法，研究了合成微生物群落参与发酵时的潜在代谢功能，重点关注了三个关键方面：微生物组成、功能基因和代谢产物。代谢组学分析确定了发酵过程中的六种关键代谢产物：尿素、精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、同型精氨酸和同型瓜氨酸。宏转录组学分析显示，总糖分、尿素和瓜氨酸是驱动黄酒发酵过程中微生物群落变化的主要因素。Limosilactobacillus fermentum和Saccharomyces cerevisiae被确定为驱动黄酒发酵的核心功能物种，并参与了乙基氨基甲酸前体的调节。此外，我们还成功重建了乙基氨基甲酸前体生成的代谢网络。这些发现有助于完善乙基氨基甲酸前体转运和代谢的理论框架，从而实现对其生成的有效调控。因此，本研究为通过应用合成微生物群落来提高其他发酵酒精食品的安全性提供了理论基础。
引言
乙基氨基甲酸（EC）是一种多部位致癌物和诱变剂，被国际癌症研究机构（IARC）归类为2A类物质（可能对人类致癌；与甲醛属于同一类别，2007年）。EC天然存在于酒精饮料、酱油、醋、面包、酸奶等发酵食品中（Shalamitskiy等人，2023年；Zhou等人，2021年）。因此，降低EC含量对于确保食品安全和保护人类健康至关重要。黄酒是中国传统的酒精饮料，作为一种营养价值高且风味独特的饮品，深受人们喜爱（Shen等人，2021年；Xie等人，2021年）。黄酒采用混合微生物发酵系统生产，其自然微生物群落具有高度多样性和复杂性（Peng等人，2022年）。因此，阐明这些自然微生物群落与EC生成之间的关联，并通过这种方法调节EC及其前体的积累仍然是一个重大挑战。近年来，合成微生物群落（SynComs）的应用受到了越来越多的关注，并在多个领域取得了成功（Jin等人，2024年；Xin和Qiao，2025年）。
由于乙基氨基甲酸具有较高的热稳定性，因此难以降解。因此，控制酒精饮料中EC含量的策略主要集中在调节其前体上。EC主要由乙醇与尿素、瓜氨酸、氨基甲酰磷酸、氰化物和二乙基焦碳酸酯的自发反应生成。其中，尿素是黄酒中EC的主要前体（Liang等人，2022年；Zheng等人，2022年）。已知尿素浓度直接影响EC含量（Wu等人，2020年）。因此，目前降低EC含量的策略主要集中在控制其主要前体尿素的形成上。调节黄酒中EC及其前体的方法主要有两种：（i）减少关键前体（如尿素和瓜氨酸）的含量以限制EC的积累；（ii）在EC形成后直接降解它。现有方法大致可分为四类：工艺优化（Abt等人，2021年）、代谢工程（Jung等人，2022年；Zhang等人，2017年）、酶法（Liu等人，2018年；Tian等人，2022a）和合成微生物群落调控（Tian等人，2024年）。其中，优化酿造工艺、改造Saccharomyces cerevisiae中的尿素和氮代谢途径以及应用酶法已被证明可以显著减少或抑制EC及其前体（尿素和瓜氨酸）的生成。然而，这些方法存在一定的局限性，难以直接控制源头。因此，利用合成微生物群落调节酒精饮料及类似发酵食品中EC及其前体的生成是一种核心技术手段。大多数现有研究仅关注单一菌株或个别调控方法的效果；然而，多种菌株协同作用下的乙基氨基甲酸前体代谢调控机制尚不清楚。因此，从“被动抑制”到“主动调控”EC前体的生成转变尚未实现。阐明SynComs的调控机制对于填补这一研究空白至关重要，因为SynComs可以模拟自然发酵系统中多种菌株的协同代谢过程。通过明确群落内不同菌株在EC前体代谢中的调控作用及其相互作用，可以精确识别出参与EC前体生物合成的关键节点和调控靶点。
SynComs具有诸多优势，包括相对简单的菌种组成、更高的效率、可控性、环境适应性和高稳定性。一个关键优势是它们能够实现代谢分工，不同成员执行特定功能，从而能够完成更复杂的任务（Kim和Bisanz，2025年；Wang等人，2025年）。近年来，通过开发SynComs，在研究和利用自然生物现象方面取得了显著进展。这些SynComs在多个领域都有应用，包括白酒风味的靶向调控（Du等人，2023年）、黄酒中关键风味化合物的鉴定（Peng等人，2025b）、低盐酱油发酵中的风味和安全性提升（Liu等人，2025a；Zhang等人，2026年）、生物降解过程（Chen等人，2023年）、土壤改良（O'Callaghan和Shi，2024年）、作物抗逆性的增强（Gon?alves等人，2023年）以及生物控制（Wang等人，2023b）。此外，理解群落成员之间的相互作用机制已成为研究的重点。在本研究中，SynComs通过精确筛选功能菌株和优化组合，实现了EC前体代谢的协调调控。这种方法不仅保留了每种菌株的个体代谢优势，还通过菌株间的相互作用特异性抑制了EC前体（如尿素和瓜氨酸）的生成。这种策略具有出色的适应性和可操作性，无需复杂的基因改造或工艺创新，可以直接应用于现有发酵系统，适用于大规模应用。
目前，SynComs已成功应用于多种发酵食品中风味的目标调控，包括豆瓣酱（Liu等人，2025b）、醋（Liu等人，2026）和酱油（Gao等人，2025）。例如，通过宏基因组分析鉴定了传统黄酒发酵剂Jiuyao的核心微生物，并通过模拟发酵进行了验证。基于这些发现，开发了一种SynCom，成功再现了黄酒的风味和感官特性，同时提高了发酵效率（Peng等人，2025b）。建立了描述SynComs组成与白酒风味之间定量关系的数学模型，从而实现了通过SynComs进行风味调控（Du等人，2023年）。此外，我们之前的研究成功构建了SynComs并模拟了黄酒发酵过程，显著降低了尿素和EC的含量（Tian等人，2024年）。然而，SynComs发挥代谢调控作用的具体机制、群落成员之间的相互作用方式以及SynComs与EC前体之间的关联仍不甚清楚。因此，本研究旨在揭示使用SynComs时发酵过程中微生物演替的驱动因素，以及关键代谢产物与主要微生物群落之间的关联。为此，我们采用了宏转录组学分析来研究SynComs发酵过程中活跃微生物的演替模式及其驱动因素，并应用代谢组学分析揭示了发酵过程中关键代谢产物的动态变化。最后，在属水平上重建了EC前体的代谢途径，并确定了SynComs中参与主要前体生成的核心功能微生物。
章节片段
黄酒的制备和样品收集
按照Tian等人（Tian等人，2024年）描述的方案，准备了早期黄酒发酵样品，并建立了初级和次级发酵的条件。确定了两种接种组合：（i）对照组，包含10%的小麦曲和7%的酒酵母；（ii）SynComs组，包含Rhizopus oryzae M5、Saccharomyces cerevisiae G2、Lactobacillus fermentum d6和Wickerhamomyces anomalus 1D6（R. oryzae M5具有……
SynComs在模拟黄酒中的发酵性能
为了评估SynComs在发酵过程中的性能，使用对照组和SynComs组进行了模拟黄酒发酵。发酵第3天和第5天时，对照组的乙醇含量增长速度明显快于SynComs组。到第10天时，SynComs组的乙醇含量显著高于对照组；然而，在……结束时，两组之间没有显著差异
结论
基于我们之前的研究结果，我们进行了整合的宏转录组学和代谢组学分析，以阐明SynComs在黄酒发酵过程中调节EC前体生成的调控机制。结果显示，整个发酵过程中尿素浓度始终保持在2.5 mg/L以下，而精氨酸和瓜氨酸浓度随着发酵的进行逐渐降低。此外，Lactobacillus fermentum和Saccharomyces
CRediT作者贡献声明
田书芳：撰写——初稿、研究、资金获取、概念构思。牛恒：方法学、数据管理。张玉燕：资源、方法学。杜国成：撰写——审稿与编辑、验证。王圆丽：资源、方法学。李梦曦：资源。李彦斌：资源、研究。刘庆涛：撰写——审稿与编辑、正式分析。
资助
本工作得到了国家自然科学基金（编号：32402269、32302246）和安徽省高等教育机构重点项目基金（编号：2025AHGXZK31063）、安徽省高校优秀青年教师培养计划（编号：YQZD2025047）、中国大学生创新创业培训计划（编号：202510363057）以及安徽省创新创业培训计划的支持
利益冲突声明
作者声明他们没有可能影响本研究工作的财务利益或个人关系。
