《Journal of Applied Genetics》：Liver response to early embryonic stimulation with xylo-and mannooligosaccharides in broiler chickens
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肠道微生物群在肠道与肝脏之间的信号传导中扮演重要角色。这两个器官通过被称为“肠-肝轴”（gut-liver axis）的双向关系相连接。本研究旨在确定在肉鸡胚胎期通过卵内注射（in ovo）给予寡糖对肝脏生理的影响。在孵化第12天，将以下物质注射入ROSS 3
肠道微生物群在肠道与肝脏之间的信号传导中扮演重要角色。这两个器官通过被称为“肠-肝轴”（gut-liver axis）的双向关系相连接。本研究旨在确定在肉鸡胚胎期通过卵内注射（in ovo）给予寡糖对肝脏生理的影响。在孵化第12天，将以下物质注射入ROSS 308肉鸡鸡蛋的气室：生理盐水（对照组）、木三糖（xylotriose, XOS3）、木四糖（xylotetrose, XOS4）、甘露三糖（mannotriose, MOS3）或甘露四糖（mannotetrose, MOS4）。寡糖的剂量为0.5 mg溶于0.2 ml生理盐水中。在42日龄时采集血液、胆汁和肝脏样本进行宰后分析。与其它组相比，MOS3组显著提高了血液中尿酸（uric acid）水平，而XOS3、XOS4和MOS3组的血镁（magnesium）浓度高于对照组。所有寡糖处理均降低了过氧化氢酶（catalase）和总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase, SOD）的活性。与其它组相比，MOS3和MOS4处理增加了肉鸡肝脏中氧化剂（oxidants）的含量。与对照组相比，XOS4处理增加了血管生成素样4（ANGPTL4）、富含半胱氨酸的血管生成诱导因子61（CYR61）、Kelch样家族成员6（KLHL6）、核受体亚家族4A组成员3（NR4A3）和脾脏酪氨酸激酶（SYK）基因的表达，而MOS3处理增加了ANGPTL4、KLHL6和NR4A3基因的表达。MOS3处理增加了ANGPTL4基因的DNA甲基化水平，而MOS4处理则降低了该基因的甲基化水平。XOS4、MOS3和MOS4处理均增加了NR4A3基因的甲基化水平。因此，可以得出结论：木聚糖寡糖（XOS）和甘露寡糖（MOS）降低了肝脏的抗氧化状态，但增加了与免疫和代谢相关基因的表达。
本研究探讨了在肉鸡胚胎孵化期间，通过卵内注射方式给予不同类型的寡糖——木聚糖寡糖（xylooligosaccharides, XOS）和甘露寡糖（mannooligosaccharides, MOS）——对肉鸡肝脏生理的影响。肝脏作为机体主要的解毒器官，具有高代谢活性，在能量底物供应、脂质代谢、蛋白质合成及糖原储存等方面发挥核心作用。其功能状态与机体健康密切相关。氧化应激（oxidative stress）是集约化肉鸡生产体系面临的重要挑战之一，而肝脏因其高代谢活性尤其易受氧化损伤。以往研究表明，益生元寡糖能改善肉鸡的抗氧化机制，但其作用途径和机制，特别是通过肠-肝轴（gut-liver axis）对肝脏产生的直接或间接影响，仍有待深入阐明。此前关于卵内给予寡糖对肉鸡肝脏代谢和免疫相关基因表达影响的研究已显示出品种特异性，且表观遗传机制如DNA甲基化（DNA methylation）在其中可能扮演的角色尚不明确。因此，本研究旨在系统评估不同XOS和MOS在胚胎期给予后，对肉鸡肝脏生化功能、抗氧化状态、以及关键免疫与代谢相关基因的表达和甲基化水平的长期影响。
为开展本研究，研究人员选用ROSS 308肉鸡种蛋，于孵化第12天通过卵内注射的方式，向实验组鸡蛋气室分别给予0.5 mg剂量的XOS3、XOS4、MOS3或MOS4，对照组注射等量生理盐水。雏鸡出壳后按常规商业饲粮程序饲养至42日龄。在42日龄时，采集血液、胆汁和肝脏样本。研究采用了一系列关键技术方法，包括：卵内注射技术建立早期胚胎刺激模型；基于分光光度法和试剂盒的血液及肝脏生化指标分析（如肝酶、氧化应激标志物、抗氧化酶活性）；胆汁酸浓度测定；基于实时荧光定量PCR（qPCR）的肝脏特定基因（ANGPTL4、CYR61、KLHL6、NR4A3、SYK）表达分析；以及采用亚硫酸氢盐转化结合qPCR（methylation-specific qPCR）技术对上述基因启动子区域特定位点的DNA甲基化水平进行检测，同时评估了全基因组甲基化水平。实验在波兰完成，动物操作符合相关伦理规定。
研究结果分析如下。在基本血液生化参数方面，卵内注射寡糖主要影响了尿酸和镁浓度。与其它所有组相比，MOS3组肉鸡血尿酸水平显著升高；而XOS3、XOS4和MOS3组的血镁浓度均显著高于对照组。在胆汁酸浓度方面，卵内刺激未影响胆汁和血液中的胆汁酸水平，但MOS3和MOS4处理组的盲肠食糜中胆汁酸浓度显著低于对照组和XOS处理组，提示MOS可能影响了胆汁酸的肠肝循环。肝脏生化分析显示，卵内刺激未影响丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）等肝酶活性，也未影响胆红素、胆固醇、甘油三酯及脂蛋白水平，表明肝脏的基础代谢功能未受损害。然而，XOS3和XOS4处理显著降低了肝脏糖原含量。
在氧化应激方面，卵内注射寡糖对血液中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）、过氧化氢酶、总SOD等活性及硫代巴比妥酸反应物（TBARS）浓度无显著影响。但在肝脏中，所有寡糖处理均显著降低了过氧化氢酶和总SOD的活性。XOS3、XOS4和MOS3还降低了线粒体锰超氧化物歧化酶（MnSOD）活性。特别值得注意的是，MOS3和MOS4处理显著提高了肝脏的促氧化剂-抗氧化剂平衡（PAB）值，表明肝脏氧化剂水平升高，抗氧化状态向促氧化方向偏移，尽管TBARS水平并未相应增加。
在基因表达层面，卵内刺激显著影响了选定基因的肝脏表达谱。XOS4处理组所有五个目标基因（ANGPTL4、CYR61、KLHL6、NR4A3、SYK）的表达均显著上调。MOS3处理组则显著上调了ANGPTL4、KLHL6和NR4A3的表达。MOS4处理仅显著上调了ANGPTL4基因的表达。这些基因涉及脂质代谢、炎症反应、免疫细胞信号转导等多个生物学过程。
在DNA甲基化分析中，研究发现寡糖处理对特定位点的甲基化产生了差异影响。对于ANGPTL4基因，MOS3处理显著提高了其甲基化水平（45.11%），而MOS4处理（36.01%）则使其低于MOS3组。对于NR4A3基因，XOS4、MOS3和MOS4处理均显著提高了其甲基化水平，其中MOS4组的甲基化程度最高（69.44%）。全基因组甲基化水平在组间无显著差异，仅MOS3组（0.51%）与MOS4组（0.18%）之间存在差异。
讨论部分总结指出，本研究证实了在胚胎发育关键期给予XOS和MOS能够对肉鸡肝脏的生理功能产生深远影响。这些寡糖通过卵内注射途径，似乎并未损害肝脏的基础代谢功能（如肝酶、胆红素、脂质代谢指标正常），但显著改变了肝脏的氧化还原状态，表现为抗氧化酶活性普遍下降和促氧化剂水平升高（尤其在MOS处理组）。这种对氧化应激平衡的扰动可能反映了机体对早期营养干预的一种适应性调节。更重要的是，XOS和MOS干预显著上调了多个与免疫应答和代谢调控相关的基因（如ANGPTL4、NR4A3、CYR61、KLHL6、SYK）在肝脏中的表达，表明其具有调节肝脏免疫和代谢功能的潜力。这种基因表达的改变与启动子区域特定位点的DNA甲基化水平变化并存，但两者并非简单的负相关关系，提示表观遗传调控机制的复杂性。研究结果为理解胚胎期营养干预通过肠-肝轴影响肉鸡长期健康提供了新的分子层面证据。
因此，本研究的结论是：卵内注射刺激木聚糖寡糖（XOS）和甘露寡糖（MOS）通过降低总超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶活性并将促氧化剂-抗氧化剂平衡（PAB）推向促氧化方向，对肉鸡肝脏的抗氧化状态产生了负面影响。然而，卵内给予这些寡糖并不会损害肉鸡后期肝脏的外分泌功能、基础肝酶活性以及胆固醇和甘油三酯的合成。此外，XOS和MOS可能上调肝脏中与免疫和代谢相关基因的表达，但这种上调似乎与基因启动子CpG岛的甲基化水平没有直接关联。
