选择性激活非核雌激素受体（non-nuclear estrogen receptor, ESR）的PaPE-1通过涉及mTOR/MEK的机制在缺氧/缺血性损伤的体外模型中发挥神经保护作用

《Pharmacological Reports》：Selective non-nuclear estrogen receptor activation with PaPE-1 evokes neuroprotection involving mTOR/MEK in an in vitro model of hypoxic/ischemic injury

　　

背景：缺氧/缺血性颅脑损伤（包括缺血性脑卒中和围产期窒息）仍是致死和长期神经残疾的主要原因，亟需能应对其多因素机制的治疗策略。雌激素受体（Estrogen Receptor, ER）信号已知具神经保护作用，但基因组ER激活伴随致癌及血栓等严重不良反应。Pathway Preferential Estrogen-1（PaPE-1）可选择性激活ER的非核（膜起始/非基因组）子集，有望在规避有害作用的同时提供神经保护。目的：阐明PaPE-1在缺氧/缺血性神经元损伤体外模型中神经保护作用的分子机制，重点关注非核ER信号及其下游通路。方法：原代小鼠皮质神经元经6 h实验性缺氧/缺血损伤后，予以PaPE-1处理后孵育18 h。进行神经元活力、细胞死亡、自噬相关囊泡形成等生化检测；采用基因与蛋白表达水平测定及表观遗传参数（全基因组DNA/RNA甲基化、基因座特异性甲基化、miRNA表达）评估PaPE-1影响；应用mTOR/MEK1/2及自噬调节剂的选择性药理抑制剂 dissect 信号通路；用ER选择性拮抗剂及特异siRNA沉默明确ER亚型参与。结果：PaPE-1激活非核ER可减轻不适配自噬（maladaptive autophagy）、RNA/DNA氧化应激损伤及神经元退变，并参与基因表达与表观遗传过程调控；其强效神经保护涉及mTOR与MEK1/2信号调节，主要由雌激素受体1（ESR1）介导。结论：PaPE-1具多靶点作用模式，对缺氧/缺血性神经元损伤具广谱保护作用；鉴于其作用复杂性及确证之强神经活性，该化合物值得在不同脑细胞类型及体内模型中进一步评价。

论文解读：Selective non-nuclear estrogen receptor activation with PaPE-1 evokes neuroprotection involving mTOR/MEK in an in vitro model of hypoxic/ischemic injury

研究背景与立题依据

缺血性脑卒中及围产期窒息等缺氧/缺血性颅脑损伤发病机制涉及氧供中断引发的兴奋性毒性、氧化应激、线粒体功能障碍及凋亡、坏死、自噬（autophagy）等多种细胞死亡途径，受磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK；含细胞外信号调节激酶ERK、c-Jun N-末端激酶JNK、p38 MAPK）及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等激酶信号网络调控。目前临床金标准重组组织型纤溶酶原激活剂（rtPA）治疗时间窗窄、疗效有限，围产期窒息常用治疗性低温也存在局限性和风险。经典雌激素通过雌激素受体（ER；主要指ESR1/ERα、ESR2/ERβ及G蛋白偶联雌激素受体GPER1）发挥神经保护，但核基因组ER激活可致乳腺癌、子宫内膜癌及静脉血栓等副作用。Pathway Preferential Estrogen-1（PaPE-1, (S)-5-(4-hydroxy-3,5-dimethyl-phenyl)-indan-1-ol）是一种通路偏好性合成雌激素，可选择性激活膜相关非核（extranuclear/nongenomic）ER信号并短暂结合ER（复合物半衰期数分钟 vs 17β-雌二醇数小时），不引起转录激活，且预测可透过血脑屏障（BBB）。前期研究证实PaPE-1延迟给药可抑制缺氧/缺血诱导的凋亡，但其对非核ER介导的mTOR/MEK信号、自噬调控、氧化损伤及表观遗传修饰的综合机制尚待阐明。该研究旨在明确PaPE-1在缺氧/缺血性神经元损伤中对mTOR和MEK通路、自噬、氧化应激及转录/后转录调控的影响及其ER亚型依赖性，发表于《Pharmacological Reports》。

主要技术方法概述

取妊娠第15天CD-1小鼠胚胎制备原代皮质神经元（混合性别）体外培养7 d。建立缺氧模型（换标准培养基后95% N₂/5% CO₂孵育6 h，O₂<0.5%）及缺血模型（无葡萄糖培养基+缺氧6 h），伤后6 h给予5 μM PaPE-1（溶于0.1% DMSO）处理18 h模拟再灌注期延迟给药。采用乳酸脱氢酶（LDH）释放法测细胞毒性、alamarBlue^TM法测细胞活力、NeuO荧光探针标记活神经元计数、神经突起生长（neurite outgrowth）染色及激光共聚焦观察自噬相关囊泡（CYTO-ID染色）；用ELISA检测自噬相关蛋白（BECN1、ATG5、ATG7、MAP1LC3A/B、NUP62）及ER亚型（ESR1、ESR2、GPER1、CYP19A1），用qPCR检测损伤/氧化应激/自噬/ER相关基因及miRNA（Mir19a、Mir132、Mir130a、Mir223、Mir140-5p等，内参Gene of interest Gapdh及Ankrd44）；通过DNA/RNA氧化损伤ELISA检测8-OHdG；用亚硫酸氢盐转化+MethyLight qPCR分析Esr1、Esr2、Gper1、Becn1、Atg7启动子区甲基化，用比色法测全基因组DNA甲基化、荧光法测全RNA 5-甲基胞嘧啶（5-mC），用HAT（组蛋白乙酰转移酶）及HDAC（组蛋白去乙酰化酶）活性检测试剂盒评估组蛋白修饰酶活性。信号通路解析使用mTORC1抑制剂temsirolimus、mTORC1/2抑制剂PP242、MEK1/2抑制剂AZD6244、JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB203580、ULK1/2抑制剂SBI-0206965/MRT68921及去泛素化酶抑制剂spautin-1预处理；ER亚型参与用ESR1拮抗剂MPP、ESR2拮抗剂PHTPP、GPER1拮抗剂G15及Esr1/Esr2/Gper1特异性siRNA验证。数据行双因素方差分析（two-way ANOVA）及Bonferroni事后检验。

研究结果

Neuroprotective effects of PaPE-1 are dependent on the mTOR and MEK

用mTORC1抑制剂temsirolimus、mTORC1/2抑制剂PP242及MEK1/2抑制剂AZD6244预处理可显著取消PaPE-1降低LDH释放、提高细胞活力的神经保护作用，而JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580无此影响，表明PaPE-1的神经保护依赖mTOR和MEK1/2激酶信号，不涉及JNK/p38 MAPK通路。

PaPE-1 changes the expression of genes associated with stroke severity and oxidative stress

缺氧/缺血上调基质金属蛋白酶Mmp2、Mmp9，精氨酸酶Arg1，Gasdermin D（Gsdmd），缺氧诱导因子1α（Hif1a），下调突触后密度蛋白Homer1及诱导型一氧化氮合酶Nos2，缺血还改变超氧化物歧化酶Sod1和谷胱甘肽过氧化物酶Gpx1；PaPE-1处理后下调Mmp2、Mmp9、Arg1、Gsdmd、Hif1a，恢复Homer1，正常化Nos2（对Sod1/Gpx1无显著影响）。缺氧/缺血致8-OHdG（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，DNA/RNA氧化损伤标志物）升高，PaPE-1显著抑制该升高。

PaPE-1 partially restores neurite outgrowth and neuronal viability

膜染色及NeuO阳性活神经元计数显示，缺氧/缺血致神经元突起减少、活细胞数下降，PaPE-1处理后部分恢复突起生长及NeuO阳性细胞数目，提示其促进神经元存活和结构重塑。

PaPE-1 inhibits hypoxia/ischemia-induced autophagy

缺氧/缺血增加自噬体（autophagosome）及总自噬相关囊泡（preautophagosome、autophagosome、autolysosome），PaPE-1显著降低其数量。ULK1/2及USP10/13抑制剂不能逆转PaPE-1的保护效应，提示PaPE-1作用不依赖ULK1/2和USP10/13。qPCR及ELISA显示PaPE-1下调自噬启动因子Becn1/BECN1、延伸因子Atg7/ATG7、Atg5/ATG5及微管相关蛋白1轻链3 Map1lc3a/Map1lc3b/MAP1LC3A/B。Becn1和Atg7启动子区出现PaPE-1诱导的高甲基化趋势（Atg7达统计学显著），提示表观遗传调控参与。

PaPE-1 exerts its neuroprotective effects primarily through ESR1 activation in models of hypoxia and ischemia

ESR1拮抗剂MPP及Esr1 siRNA消除PaPE-1的神经保护；ESR2拮抗剂PHTPP及Esr2 siRNA部分减弱缺氧模型中的保护；GPER1拮抗剂G15无影响，Gper1 siRNA反而增强保护。Western blot分膜/胞质组分显示PaPE-1增加缺血模型中膜ESR1、降低胞质ESR2（伤后上调）；伤后Esr1 mRNA下调但PaPE-1未逆转，且不改变核ER靶基因Cyp19a1（aromatase）表达，符合非基因组机制。PaPE-1引起Esr1及Esr2启动子低甲基化（hypomethylation）。

PaPE-1 modulates epigenetic mechanisms by restoring HAT levels and regulating the expression of ischemia-responsive miRNAs

缺血模型中PaPE-1降低全基因组DNA 5-mC%（缺氧模型呈相似趋势但未达显著），全局RNA甲基化无变化。PaPE-1恢复缺氧/缺血下调的HAT活性及上调降低的HDAC活性。miRNA分析中，PaPE-1下调缺血上调的有害miRNA（Mir130a、Mir132、Mir223），进一步上调已升高的保护性Mir19a。

讨论与结论总结

讨论指出PaPE-1通过选择性激活膜ESR1（部分涉及ESR2）触发非核ER信号，经mTOR和MEK1/2通路发挥多效神经保护：抑制过度自噬（下调Becn1、Atg7、Map1lc3等并伴启动子高甲基化）、下调Mmp2/9、Arg1、Gsdmd、Hif1a、Nos2并恢复Homer1、减轻8-OHdG氧化损伤、部分恢复神经元存活与突起生长、引起Esr1/Esr2启动子低甲基化及恢复HAT/HDAC平衡、调控缺血相关miRNA表达。其不激活核ER靶基因（Cyp19a1等），避免了经典雌激素治疗的致癌/血栓风险。mTOR/MEK依赖而JNK/p38不参与的作用谱使其区别于广泛激酶的激活。研究局限性含未直接检测mTOR/MEK磷酸化水平及体内验证，且未区分性别差异（计划后续用体内光血栓脑卒中模型补充）。

结论（翻译）：选择性激活非核ER是颇具前景的多疾病干预方向，PaPE-1的多靶点特性使其成为该策略设计中的重要候选物。基于本研究及前期工作，研究人员提出PaPE-1的强效神经保护源于多分子因素交互而非单一机制——主要通过非核ER激活调节mTOR和MEK1/2信号，减轻凋亡、失调配自噬及神经元退变。PaPE-1于伤后6 h延迟给药，其效应早期由非基因组机制介导，继而影响基因表达与信号通路，长期可能通过基因甲基化和组蛋白乙酰化产生延续效果。鉴于其作用复杂性和确证的强神经保护活性，该化合物值得在不同脑细胞类型及体内模型中进一步研究验证。