《Journal of Biological Chemistry》：Lactate-fueled H3K18 lactylation sustains ΔNp63α-dependent self-renewal in limbal epithelial stem cells
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代谢重编程与表观遗传调控相互作用调控干细胞命运的机制尚不完全清楚，特别是对角膜稳态至关重要的角膜缘上皮干细胞(limbal epithelial stem cells, LESCs)。本研究中，研究人员发现糖酵解来源的乳酸(lactate)是通过表观遗传机制维
代谢重编程与表观遗传调控相互作用调控干细胞命运的机制尚不完全清楚，特别是对角膜稳态至关重要的角膜缘上皮干细胞(limbal epithelial stem cells, LESCs)。本研究中，研究人员发现糖酵解来源的乳酸(lactate)是通过表观遗传机制维持LESC自我更新(self-renewal)的关键代谢调节因子。研究人员通过MYC过表达(oeMYC-LESCs)建立了类祖细胞(progenitor-like)的LESC模型，结合CUT&Tag、RNA-seq及小鼠角膜上皮损伤模型发现，oeMYC-LESCs表现为糖酵解增强及乳酸外流增加，后者为p300/CBP介导的组蛋白乳酰化(lactylation)——尤其是组蛋白H3第18位赖氨酸乳酰化(histone H3 lysine 18 lactylation, H3K18la)提供底物。H3K18la富集于ΔNp63α启动子区驱动其转录激活，从而维持LESC自我更新。抑制乳酸生成可降低H3K18la水平、抑制ΔNp63α表达，进而损害LESC功能；外源补充乳酸可部分回救上述表型。体内实验证实，乳酸以H3K18la依赖的方式加速角膜上皮再上皮化(re-epithelialization)并上调ΔNp63α；而药物阻断乳酸产生则延迟伤口愈合。综上，本研究揭示了乳酸—H3K18la—ΔNp63α轴作为维持LESC自我更新的关键代谢—表观遗传—转录调控机制，为治疗角膜缘干细胞缺乏症(limbal stem cell deficiency, LSCD)提供了新靶点。
论文解读：Lactate-fueled H3K18 Lactylation Sustains ΔNp63α-dependent Self-Renewal in Limbal Epithelial Stem Cells
研究背景与意义
角膜缘上皮干细胞(limbal epithelial stem cells, LESCs)定位于角膜缘Vogt栅栏结构，通过自我更新(self-renewal)和定向分化维持角膜上皮稳态。LESC或其微环境(niche)受损可导致角膜缘干细胞缺乏症(limbal stem cell deficiency, LSCD)，表现为持续性上皮缺损、角膜结膜化及溃疡，严重者可致盲。目前自体角膜缘组织移植(Holoclar?等)是LSCD有效疗法，但体外扩增过程中LESC自我更新能力的丧失是影响移植疗效的关键瓶颈，而调控LESC自我更新的分子机制尚未阐明。近年研究表明干细胞倾向进行有氧糖酵解(Warburg效应)，乳酸(lactate)不仅是代谢终产物，更是信号分子和组蛋白乳酰化(lactylation)——一种新型表观遗传修饰的前体，其中H3K18la被报道可促进多能性相关基因表达。然而乳酸—组蛋白乳酰化轴是否及如何调控LESC自我更新尚不清楚。该研究由Longfei Li、Bin Xu等来自中国海洋大学的研究团队完成，发表于《Journal of Biological Chemistry》，揭示了乳酸—H3K18la—ΔNp63α代谢—表观遗传—转录轴维持LESC自我更新及促进角膜上皮修复的新机制，为LSCD治疗提供潜在新靶点。
主要关键技术方法
研究人员分离培养兔原代LESCs，通过慢病毒转染建立MYC过表达(MYC-overexpression, oeMYC-LESCs)类祖细胞模型，并以晚代次(passage 10–15, 晚期传代LESCs)作对照。采用细胞外酸化率(extracellular acidification rate, ECAR)与耗氧率(oxygen consumption rate, OCR)检测糖酵解及氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)；非靶向代谢组学分析代谢物变化；CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)联合RNA-seq鉴定H3K18la富集位点及差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)；Western blot及免疫荧光检测组蛋白乳酰化(Pan-Kla、H3K18la)、干性标志物(ΔNp63α、ABCG2、ATF3)及分化标志物(CK3、CK12)；CCK-8检测细胞活力、EdU掺入及流式细胞术分析细胞周期与克隆形成评估增殖与自我更新能力；应用糖酵解抑制剂2-DG(2-deoxyglucose)、LDHA抑制剂oxamate、MCT1抑制剂AZD3965、p300/CBP抑制剂(Lys-CoA TFA、GNE-207)及外源乳酸干预；建立C57BL/6小鼠中央角膜上皮机械划伤模型，局部给予oxamate或乳酸滴眼液，通过荧光素钠染色、光学相干断层扫描(optical coherence tomography, OCT)评估上皮修复及中央角膜厚度(central corneal thickness, CCT)，组织学及免疫组化验证体内H3K18la与ΔNp63α变化。
研究结果
A progenitor-like LESC line was established（建立类祖细胞样LESC系）
研究人员基于高自我更新能力LESCs高表达MYC的现象，在晚代次LESCs中过表达MYC建立oeMYC-LESCs。形态呈铺路石样，高表达干性标志物ABCG2与ΔNp63α，不表达分化标志物CK3，基因表达谱近似角膜缘祖细胞(limbal progenitor cells, LPCs)；细胞活力、EdU阳性率、G1/S期转换及克隆形成能力均显著强于晚代次LESCs，证明oeMYC-LESCs成功模拟具有高自我更新能力的LESC祖细胞表型。
Lactate metabolism potentially promoted LESC self-renewal via lactylation（乳酸代谢可能经乳酰化促进LESC自我更新）
oeMYC-LESCs糖酵解ECAR升高、糖酵解及三羧酸循环(TCA)中间产物富集，但胞内乳酸偏低而胞外乳酸显著升高，伴随MCT1(monocarboxylate transporter 1)上调。抑制MCT1减少乳酸外流；同时LDHA/LDHB上调，OCR升高提示部分乳酸经乳酸—丙酮酸穿梭进入线粒体供能；此外p300/CBP表达上调且全局赖氨酸乳酰化(Pan-Kla)升高，p300/CBP抑制后Pan-Kla下降。晚代次LESCs经5 mM外源乳酸处理可提高细胞活力、EdU掺入、促细胞周期进展并上调ΔNp63α、ABCG2、ATF3及Pan-Kla/H3K18la，表明乳酸通过乳酰化依赖机制促进LESC自我更新。
H3K18la emerged as a critical epigenetic modification regulating LESC self-renewal（H3K18la是调控LESC自我更新的关键表观遗传修饰）
用2-DG或oxamate抑制乳酸生成使oeMYC-LESCs内乳酸降低，Pan-Kla尤其H3K18la剂量依赖性下降，干细胞相关基因(TP63、ATF3)下调，细胞增殖与克隆形成受抑。外源补充5 mM乳酸可部分恢复被oxamate抑制的H3K18la水平及细胞活力、增殖与克隆形成能力。siRNA敲低LDHA/LDHB同样降低Pan-Kla与H3K18la并损害自我更新，证实H3K18la乳酰化是乳酸维持LESC自我更新的关键机制。
H3K18la directly activated ΔNp63α transcription to maintain LESC self-renewal（H3K18la直接激活ΔNp63α转录以维持LESC自我更新）
CUT&Tag显示H3K18la富集于启动子区，整合RNA-seq发现TP63(编码ΔNp63α)和ATF3为共同靶基因。ΔNp63α是LESCs中TP63主要异构体，CUT&Tag-qPCR证实H3K18la特异性富集于ΔNp63α启动子，oxamate处理后此富集减弱并伴ΔNp63α mRNA与蛋白下调。敲低ΔNp63α降低干性标志物、抑制增殖与克隆形成；晚代次LESCs过表达ΔNp63α则提升活力与增殖，证明H3K18la通过直接激活ΔNp63α转录维持LESC自我更新。
The H3K18la-ΔNp63α axis drives corneal epithelial regeneration in vivo（H3K18la—ΔNp63α轴驱动体内角膜上皮再生）
小鼠角膜上皮损伤模型中，局部给予乳酸加速伤口闭合(第3天即快于对照组，第7天完全愈合)、促进中央角膜厚度恢复、H3K18la与ΔNp63α核染色增强；oxamate处理延迟上皮修复、伴持续水肿、炎症浸润、H3K18la与ΔNp63α降低；免疫荧光共染显示乳酸增强ΔNp63α阳性细胞中H3K18la信号。证实乳酸通过H3K18la—ΔNp63α轴促进体内角膜上皮再上皮化及角膜缘干细胞稳态维持。
讨论与结论翻译
研究人员发现糖酵解产生的乳酸通过p300/CBP催化的组蛋白H3第18位赖氨酸乳酰化(H3K18la)直接激活ΔNp63α启动子驱动其转录，从而维持角膜缘上皮干细胞(LESCs)自我更新；体内实验验证乳酸补充经此轴加速角膜上皮再生。该代谢—表观遗传—转录偶联网络为角膜缘干细胞缺乏症(limbal stem cell deficiency, LSCD)的治疗提供了新干预思路。
Conclusions（结论）：本研究阐明了一条连接代谢重编程与LESC命运表观遗传调控的关键网络——糖酵解来源乳酸为组蛋白乳酰化提供底物，特异地生成H3K18la，其直接结合并激活ΔNp63启动子以维持自我更新；体内实验进一步证实乳酸补充经H3K18la–ΔNp63α轴加速角膜上皮再生，凸显靶向此代谢—表观遗传—转录互作作为LSCD新型治疗策略的潜力。
