《Chemosphere》：Large-scale phenotyping in a wild rhabditid nematode and C. elegans reveals differential neurobehavioral responses to a nanoscale pollutant and temperature
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摘要：环境因素通过统称为“暴露组”的复杂相互作用塑造机体健康。然而，化学与非化学暴露组因子之间的相互作用仍知之甚少。本研究利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的一种多巴胺能报告株系（BZ555 egIs1 [dat-1p::GFP]
摘要：环境因素通过统称为“暴露组”的复杂相互作用塑造机体健康。然而，化学与非化学暴露组因子之间的相互作用仍知之甚少。本研究利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的一种多巴胺能报告株系（BZ555 egIs1 [dat-1p::GFP]）和一种野外分离的杆状线虫（rhabditid nematode），在行为学测试平台中评估了它们对二氧化硅纳米颗粒（一种化学暴露组因子）和不同环境温度条件（15 °C, 20 °C, 和 25 °C，作为非化学因子）的运动行为自然变异。研究结果揭示，在秀丽隐杆线虫报告株系中，较低温度（15 °C）可缓解二氧化硅诱导的运动缺陷，而较高温度（25 °C）则加剧其神经毒性，表明存在一种温度依赖性的响应。值得注意的是，野生杆状分离株表现出与实验室株系截然不同的行为反应，突显了物种特异的生态背景在毒理学研究中的重要性。通过从大规模定量行为学研究中生成“暴露组-表型图谱”，本研究扩展了跨类群识别纳米材料生态毒理学危害的能力。
## 纳米污染物与温度对野生杆状线虫及秀丽隐杆线虫的差异化神经行为响应：一项大规模表型学研究
在生物医学与生态毒理学研究中，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是广泛使用的模式生物。其野生环境为污染物汇集地，如土壤、淡水沉积物和腐烂有机质。这些自由生活的线虫是理解复杂环境暴露生物学影响的重要指示生物。“暴露组”涵盖了一个生物体一生中所经历的所有化学、生物和物理暴露。随着环境建模技术的发展，可以预测环境汇中的污染物浓度，改进外部暴露组的量化。工程化二氧化硅纳米颗粒是一个突出例子，其在欧洲年产量估计达数万吨，建模研究预测其在土壤中的年中位累积量约为0.43 mg kg
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-1。为了提升分子研究的生态学有效性，科学家可以进行实地分子生物学研究或采集环境样本（如野生线虫）用于后续实验室分析。
秀丽隐杆线虫因其与人类在遗传上的相似性，成为研究人类衰老和疾病分子通路的强大模型。它拥有一个紧凑的基因组，包含约19,000个蛋白质编码基因，其中约60-80%的基因具有人类直系同源基因，且常执行相似功能。这种遗传保守性延伸至关键生化通路，例如胰岛素/IGF-1信号通路，该通路同样是人类衰老和代谢的核心。其神经系统由恰好302个神经元构成，已在突触水平上完全测绘，并使用多种保守神经递质。表达荧光标记物的转基因报告株系允许可视化产生这些神经递质的单个神经元。然而，其神经系统也是包括特定纳米颗粒在内的污染物的首要靶点，这些污染物可引起以神经退行性变（neurodegeneration）为特征的神经毒性（neurotoxicity）。神经毒性过程中对单个神经元的损伤会扰乱神经传递和神经回路，导致神经功能损害和行为改变。
为了在包含多个交互因子的动态暴露组背景下研究神经毒性，研究人员利用秀丽隐杆线虫的大规模行为学平台，以期更全面地理解暴露场景。在此基础上，将相同的测试范式应用于一种野生杆状线虫分离株，以评估其对环境胁迫因子的自然变异响应。该野生分离株被暴露于代表不同物理化学特性的多种二氧化硅纳米颗粒（化学环境条件）以及15 °C、20 °C和25 °C的环境温度（非化学环境条件）下。对弯曲频率、每次弯曲距离、速度和面积等不同运动表型的大规模测量显示，秀丽隐杆线虫报告株系和野生杆状分离株对纳米二氧化硅和环境温度的联合环境因子表现出不同的反应。获得的见解拓宽了对环境胁迫响应的理解，并为最终整合“同一健康”（One Health）方法的生态暴露组框架的发展提供了初步贡献。
本研究采用的主要关键方法包括：1. **模式生物与野外分离株**：使用了具有多巴胺能神经元荧光标记（dat-1p::GFP）的秀丽隐杆线虫报告株系（BZ555 egIs1），以及从德国杜塞尔多夫市城市道路旁土壤中分离并实验室培养的野生杆状线虫（雌雄异体）。2. **暴露体系**：将年龄同步化的L4龄幼虫或成虫在96孔板的液体培养基中暴露于不同浓度（1, 10, 100, 200, 500 μg/mL）的三种二氧化硅纳米颗粒（50 nm单分散纳米颗粒、12 nm气相二氧化硅Aerosil? 200、20 nm气相二氧化硅Aerosil? 90）以及作为块状参考的500 nm二氧化硅颗粒，并在三种环境温度（15 °C, 20 °C, 25 °C）下孵育72小时。3. **大规模行为分析平台**：采用开源的宽视野线虫追踪平台（Wide-Field-of-View Nematode Tracking Platform, WF-NTP），结合定制R脚本，对单个线虫进行视频记录和分析，自动提取平均速度、最大速度、每30秒弯曲次数、每次弯曲距离和身体面积等多参数运动行为数据。整个研究共分析了11,029条秀丽隐杆线虫和21,486条野生杆状线虫。
### 3.1 二氧化硅纳米颗粒改变秀丽隐杆线虫egIs1株系的运动行为
研究人员首先利用秀丽隐杆线虫报告株系，通过单虫追踪技术量化了不同二氧化硅纳米颗粒诱导的神经退行性变与行为学改变之间的联系。测量显示，平均速度和最大速度对单分散二氧化硅纳米颗粒最为敏感，在浓度≥100 μg/mL时显著降低。相比之下，常用的参数“每30秒弯曲次数”在观察到的最低效应浓度（near-LOEL）附近（100 μg/mL）不那么敏感。分析表明，速度是量化新兴污染物（如纳米颗粒）暴露后神经功能的一个敏感且可靠的参数。单个线虫的轨迹可视化显示，对照组呈现长而直的移动，而暴露于纳米颗粒的线虫轨迹则逐渐变短或呈圆形，反映出个体间的抗性与易感性差异。这证实了单虫分析对于理解纳米材料神经毒性的重要性。
### 3.2 不同二氧化硅纳米材料对秀丽隐杆线虫运动行为产生差异性影响
对比具有不同物理化学特性的二氧化硅纳米颗粒的影响，研究发现单分散二氧化硅纳米颗粒和Aerosil 200对秀丽隐杆线虫运动能力的损害强于Aerosil 90。通过二维散点图分析（以每30秒弯曲次数为X轴，速度为Y轴），结果显示在浓度≥100 μg/mL时，暴露个体的数据点向下方区域偏移，表明速度降低而弯曲频率基本不变。这种模式代表了一种特定的运动步态（gait），凸显了散点图能够捕捉纳米颗粒诱导的详细运动特征。综合分析表明，这些纳米颗粒主要降低运动速度，可能通过影响血清素能神经传递实现。
### 3.3 单分散二氧化硅纳米颗粒与环境温度的联合效应对秀丽隐杆线虫运动行为的影响
为评估温度依赖性，研究人员在15 °C、20 °C和25 °C下记录了暴露于单分散二氧化硅纳米颗粒72小时后的线虫轨迹。单虫追踪显示，在15 °C时，浓度高达100 μg/mL的暴露仅引起轻微变化；在20 °C时，200和500 μg/mL的暴露导致轨迹显著缩短或呈点状（表明运动活性完全丧失）；在25 °C时，运动能力的降低在接近LOEL的100 μg/mL浓度时就已发生。定量分析证实了浓度依赖性的运动速度下降，尤其在25 °C下更为显著。这些结果表明，较高的环境温度加剧了纳米二氧化硅诱导的秀丽隐杆线虫运动缺陷，突显了温度在纳米材料毒性评估中的重要性。
### 3.4 利用自动化单虫追踪技术对野生杆状线虫分离株进行行为谱分析
从城市土壤中分离并鉴定了一株形态上与秀丽隐杆线虫相似的野生杆状线虫。该分离株为雌雄异体。在行为学测试中，与秀丽隐杆线虫相比，其基态运动速度普遍较慢。暴露于二氧化硅纳米颗粒后，浓度达到200 μg/mL及以上时，其速度和面积相较于对照组显著降低。作为阳性对照，乙酰胆碱酯酶抑制剂灭多威（aldicarb）完全抑制了其运动，证明该野生分离株与秀丽隐杆线虫之间存在保守的胆碱能神经传递。
### 3.5 二氧化硅纳米颗粒与环境温度的联合效应对野生杆状分离株运动行为的差异化影响
对比不同二氧化硅纳米材料，单分散二氧化硅纳米颗粒对野生杆状分离株的运动能力影响最显著，LOEL浓度为200 μg/mL；而Aerosil 90和Aerosil 200对其轨迹几乎没有影响。散点图分析进一步证实，单分散纳米颗粒暴露导致速度和弯曲频率均下降，而Aerosil 90和200暴露组的数据分布与对照组相似，甚至有部分个体向右上方区域偏移，提示运动活性可能增强。这是首次报道二氧化硅纳米材料对野生线虫可能产生的刺激效应。
评估温度影响时发现，在15 °C下，单分散二氧化硅纳米颗粒在浓度≥1 μg/mL时即增加了运动速度；而在20 °C和25 °C下，浓度≥200 μg/mL时则会降低运动能力。这表明线虫对二氧化硅纳米颗粒的反应是温度依赖且物种特异的：野生杆状分离株在15 °C下表现出运动刺激效应，而在较高温度下则逆转为抑制效应；实验室秀丽隐杆线虫株系则缺乏这种刺激效应。
### 3.6 C. elegans与野生杆状分离株对暴露组因子的物种特异性行为响应
对比两种线虫对不同纳米材料的响应，秀丽隐杆线虫在暴露于单分散纳米颗粒和Aerosil 200后，主要表现为速度降低，而弯曲频率基本不变；Aerosil 90的影响则很轻微。相比之下，野生杆状分离株的整体运动水平较低，暴露于单分散纳米颗粒后，速度和弯曲频率均显著降低，而对Aerosil 90和200基本无反应。这些发现表明了物种特异的敏感性差异。
### 3.7 迈向秀丽隐杆线虫与野生杆状分离株运动行为的暴露组图谱
研究人员利用大规模单虫追踪平台，生成了涵盖多种暴露组变量的“暴露组-行为图谱”。该图谱整合了多种化学因子（三种二氧化硅纳米材料、块状二氧化硅）、浓度梯度（1-500 μg/mL）和环境温度（15-25 °C）。可视化结果揭示了两种线虫在压力韧性上的显著差异：在二氧化硅纳米颗粒暴露下，秀丽隐杆线虫普遍表现出运动抑制（图谱显示为红色），而源自低基态运动活性的野生分离株则维持甚至增强其运动（图谱显示为绿色）。这种运动反应表现出温度依赖性和物种特异性：野生分离株在15 °C下表现出刺激效应，在20 °C和25 °C下减弱或逆转；而秀丽隐杆线虫仅在1或10 μg/mL的低浓度下于25 °C表现出轻微刺激效应，主要表型仍是运动抑制。
## 讨论与结论
**讨论部分总结**：传统线虫研究主要依赖于驯化株系（如N2），以获得良好的重现性。相比之下，野外采集的线虫提供了生态知情的模型系统，能捕捉自然变异和环境暴露历史。本研究证实，野生分离株表现出与实验室秀丽隐杆线虫株系截然不同的行为反应，强调了自然变异在塑造毒理学结果中的重要性。纳入野外分离株符合新兴的“将田野带入实验室”范式，通过在受控实验室环境中整合具有自然生态暴露历史的生物体，增强了研究的环境真实性。未来优先事项包括对野生杆状线虫进行基因组测序、标准化实验方案以及进行种群水平验证，以建立田间衍生线虫作为稳健且生态相关的毒理学模型。这种方法增强了环境现实性，支持对生物体应对复杂胁迫因素的综合理解，并加强了线虫神经毒性与人类健康之间的转化联系。
**结论部分翻译**：综上所述，本研究通过大规模行为表型学分析，揭示了二氧化硅纳米颗粒这一化学暴露因子与环境温度这一非化学暴露因子在秀丽隐杆线虫和一种野生杆状线虫中引起的差异化神经行为响应。研究初步构建了“暴露组-行为表型”图谱，证实了纳米材料的神经毒性效应具有显著的物种特异性和温度依赖性。野生线虫表现出与实验室株系不同的压力响应模式，甚至在特定条件下出现刺激效应，突显了将生态背景纳入纳米毒理学评估的重要性。这些发现强调了在复杂暴露组背景下理解环境胁迫响应的必要性，并为建立整合了“同一健康”理念的生态暴露组框架做出了初步贡献。
