《Human Pathology》：Single Cell Sequencing in Acute Myeloid Leukemia: Linking Genotype to Functional Phenotype for Precision Risk Stratification and Treatment Decisions
急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一种以髓系前体细胞克隆性扩增为特征的侵袭性血液系统恶性肿瘤。其病理评估整合了多层面的特征分析：包括外周血与骨髓循环细胞的形态学观察、通过免疫组织化学及流式细胞术免疫分型鉴定原始细胞谱系，以及包含核型分析、荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization, FISH）和下一代测序（next generation sequencing, NGS）在内的遗传学研究。NGS分析目前已常规用于界定AML的突变图谱，为风险分层和治疗选择提供依据。然而，临床实践中现行的免疫表型分类仅采用数量有限的表面标志物粗略判定造血谱系，而批量测序方法大多无法精准捕捉克隆复杂性、解析突变获得顺序，也难以区分残留白血病与克隆性造血（clonal hematopoiesis, CH）。单细胞测序技术突破了经典造血层级框架，能够定义过渡性细胞状态，以前所未有的分辨率揭示克隆复杂性，从而革新了对正常与恶性造血的认知。涵盖基因组学、转录组学、蛋白质组学、表观基因组学和代谢组学的单细胞多组学策略，有望解析AML中巨大的疾病异质性，解决遗传亚型与功能表型之间的不一致性，并优化风险分层。最新的前沿空间单细胞技术将这类多组学策略应用于原位细胞研究，为骨髓微环境提供了全新视角。本文综述了单细胞测序技术在AML全病程中的应用：包括初诊、缓解期可测量残留病（measurable residual disease, MRD）评估以及复发时的克隆演化，并展望了未来可能影响临床实践的转化方向。
引言
急性髓系白血病（AML）是一种以髓系前体细胞克隆性扩增为特征的侵袭性血液系统恶性肿瘤，其发生部分源于年龄累积的造血干/祖细胞反复遗传改变，即克隆性造血（CH）。AML的诊断依赖多种病理工具：组织学评估细胞形态，免疫组织化学（IHC）与流式细胞术免疫分型界定原始细胞谱系，核型分析、荧光原位杂交（FISH）及下一代测序（NGS）明确遗传学异常。这些批量分析技术可识别髓系肿瘤的反复突变基因与染色体改变，对分型、风险分层及治疗至关重要，靶向或全转录组RNA测序还可检出隐匿融合转录本及可被靶向治疗的转录程序激活，推动AML分类从法国-美国-英国（French-American-British, FAB）形态学分型转向以遗传学异常为核心的现代分型体系。
但即便在相同形态学与遗传亚型内，患者临床结局仍存在显著异质性，亟需更高分辨率的精细技术解析功能异质性以优化风险分层。现行免疫表型分类仅依靠IHC与流式检测少量表面标志物，难以全面覆盖白血病样本的分化状态谱——AML常包含从“白血病干细胞（leukemia stem cells, LSCs）”到部分模拟髓系发育的更分化细胞的连续状态，LSCs因自我更新能力及对治疗的相对抵抗驱动疾病进展，而分化细胞也可通过损害肿瘤微环境或造血功能影响疾病行为。大规模批量NGS研究虽已界定AML突变图谱并推断突变获得顺序（早期高频变异等位基因频率（variant allele frequency, VAF）突变多影响表观调控因子，后期低VAF突变多涉及信号通路基因），但无法解析同一克隆内的共突变事件，也难以区分缓解期的残留白血病与背景克隆性造血，这对可测量残留病（MRD）判定尤为关键。
单细胞测序技术的出现突破了批量分析的局限：单细胞RNA测序超越了经典造血层级，定义了髓系分化轨迹中的过渡细胞状态，以前所未有的分辨率优化谱系分类并表征肿瘤微环境；单细胞DNA测序可解析克隆异质性，实现单细胞水平的突变共现分析及线性、分支型克隆演化模式重建；单细胞多组学整合基因组、转录组、蛋白质组、表观基因组等多层面数据；空间技术则实现了原位微环境中的细胞分析，填补了既往技术需解离标本的空白。这些技术有望解决遗传亚型与功能表型的不一致性，提升风险分层准确性，最终指导治疗决策。本文将系统梳理单细胞测序技术在AML初诊、缓解期MRD评估及复发克隆演化三个阶段的研究进展。
单细胞技术
临床常规批量测序仅能提供标本的“平均”结果，丢失大量克隆复杂性信息；流式细胞术免疫分型与核型分析虽可捕获部分异质性，但单细胞测序直接在单细胞水平获取数据后再聚合，完整保留了克隆复杂性，可实现前所未有的瘤内异质性解析。现有单细胞技术覆盖RNA、DNA、表面蛋白表达、染色质可及性及DNA甲基化分析，多数平台支持“多组学”同步检测，最新空间组学还可保留细胞互作与微环境信息。
单细胞RNA测序
单细胞RNA测序（scRNAseq）是最成熟的技术，流程包括单细胞分离、裂解、poly(T)引物逆转录、扩增及文库纯化。根据研究目的可选择全长测序（如SmartSeq2，转录组覆盖度高，可分析转录变体与异构体，但通量低且无唯一分子标识符（unique molecular identifiers, UMIs），限制定量准确性）或3’/5’端测序（如10X Genomics，通量高、成本效益好，适合大规模细胞聚类，但缺乏详细转录本信息）；长读长测序（如Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies）可避免片段化，直接定量全长转录本；SmartSeq3等新方案则整合了5’标签读段定量与内部读段异构体分析的优势。
scRNAseq应用于急性白血病的核心挑战是仅凭基因表达无法可靠区分白血病与非白血病细胞。早期转录组基因分型（genotyping of transcriptomes, GoT）依赖mRNA来源的DNA文库，仅能检测表达且位于转录本3’/5’端的突变，存在等位基因丢失率高、仅能检出高VAF突变等局限；后续TargetSeq等方案可同步检测单细胞基因组与编码DNA的突变，结合长读长纳米孔测序也可实现突变状态判定。此外，CloneTracer等计算工具可整合单细胞单核苷酸变异（single nucleotide variants, SNVs）、线粒体SNVs并推断拷贝数变异（copy number variants, CNVs），通过统计模型推导克隆层级并概率性分配单细胞至对应克隆，但需预先通过批量测序获知病例的突变信息。
单细胞DNA测序
早期单细胞基因分型为基于流式分选的单细胞板法PCR，通量局限于96或384孔板；全基因组扩增技术的进步推动了单细胞全基因组测序的发展，如BioSkryb公司的ResolveDNA方案采用的初级模板导向扩增（primary template-directed amplification, PTA）。微流控与分子条形码技术的进步催生了液滴法，可将单细胞、带独特条形码引物的微球及试剂包裹为纳升级液滴，实现102-10?个细胞的高通量分析，代表性平台为MissionBio Tapestri。当前单细胞基因分型的局限包括等位基因丢失（以中位等位基因丢失率（median allele dropout, ADO）量化）影响突变检出的可靠性，以及GC富集区扩增子覆盖度低（如GATA2、SRSF2、TP53及部分RUNX1区域）。针对大片段结构变异的检测则需特殊技术，如结合StrandSeq的单细胞核小体占位与遗传变异分析（single-cell nucleosome occupancy and genetic variation analysis, scNOVA）。
其他单细胞分析技术
除基因型与转录状态外，细胞代谢、表观遗传因素（染色质结构、组蛋白组成）同样参与细胞异质性调控。相应技术包括转座酶可及染色质单细胞测序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, scATAC-seq）、单细胞质谱流式、抗体衍生标签（antibody-derived tags, ADTs）表面蛋白质组学，以及通过翻译抑制谱分析的单细胞能量代谢检测（single-cell energy metabolism by profiling the translation inhibition, SCENITH）。
多组学
多组学技术可同步评估细胞状态与多层面分析物，已广泛应用于正常造血研究，揭示了分化轨迹中的过渡细胞状态，挑战了经典造血层级。联合单细胞DNA-RNA测序技术包括G&T-seq、DR-Seq、SDR-seq；CITE-Seq（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing）可在单细胞转录组分析中同步检测表面蛋白，已构建了人类造血图谱，为急性白血病细胞身份鉴定提供参考；Mission Bio Tapestri系统可整合分子谱与表面蛋白表达，进一步解析基因型-表型关联；10X Genomics等商业平台也推出了支持探针基因表达与胞内、表面蛋白分析的多组学方案。scRNAseq与scATAC-seq的结合已绘制了人类造血分化的基因调控景观，GoT-ChA（Genotyping of Transcriptomes and Chromatin Accessibility）技术则可同步实现靶向位点基因分型、scATAC与scRNA测序。这些多组学研究共同深化了对AML异常分化轨迹的认知。
空间测序技术
传统流式与液滴多组学需解离细胞，丢失空间组织与细胞互作信息，空间技术弥补了这一缺陷。空间蛋白质组学整合免疫荧光与质谱流式（imaging mass cytometry, IMC），可在单细胞水平实现空间定位，结合相邻切片的苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色，可在骨髓微环境结构背景下解读结果，但受限于靶向检测的通量。
空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）可分为成像法与测序法两类：成像法利用单分子荧光原位杂交（single-molecule fluorescence in situ hybridization, smFISH）同时检测数千种RNA转录本的空间位置与表达水平；测序法将空间条形码阵列排列为斑点，结合NGS确定组织中转录本的位置与表达水平，如Visium平台可实现全转录组无偏分析，但斑点尺寸（≥55 μm）大于哺乳动物细胞平均直径（约10 μm），缺乏单细胞分辨率，Visium HD将斑点缩小至2 μm且无间隙，接近单细胞尺度；Xenium与CosMX为靶向ST平台，结合了成像与原位测序技术，可定制化检测特定基因，在单细胞分辨率下提供深度分析。
空间技术在骨髓疾病中的应用曾受限于骨组织脱钙过程对核酸的损伤，盐酸或甲酸脱钙会破坏核酸完整性，而乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）脱钙虽耗时更长，但可有效保存核酸产量与质量，目前已成功将10X Xenium平台应用于人骨髓标本的空间转录组分析。
初诊阶段解析克隆异质性/复杂性以优化风险分层
单细胞RNA测序——分化状态
scRNAseq可以前所未有的分辨率解析细胞分化状态，精准界定患者白血病的组成细胞类型。早期研究中，Van Galen团队利用该技术识别出与AML治疗失败相关的罕见化疗抵抗性干样群体，并通过短读长与长读长纳米孔测序同步检测全转录组扩增产物，鉴定出6种恶性细胞类型（从干/祖样到更分化的单核细胞样），且不同基因型对应特定分化特征（如FLT3-ITD突变富集祖样细胞，FLT3-TKD突变富集更分化AML细胞）。Zeng等整合既往scRNAseq数据构建了人类造血分化单细胞参考图谱，对300余例成人及儿童AML的单细胞转录组进行荟萃分析，定义了12种反复出现的异常分化模式，每种模式可由多种遗传驱动因素引起，反映了“转化细胞”（白血病起源的最后正常或癌前细胞）身份与白血病干细胞（LSCs）的分化轨迹潜能两个核心维度。后续针对NPM1突变AML的多组学研究也验证了该模型，观察到三种转录亚型，对应不同比例的早幼粒细胞样或成熟髓系样白血病细胞，支持NPM1突变AML起源于具有不同分化潜能的祖细胞。
单细胞DNA测序——基因组图谱
批量测序对克隆结构与突变顺序的推断依赖于VAF与杂合突变假设，存在固有局限。单细胞DNA测序可直接解析复杂克隆结构：早期板法靶向PCR研究已在NPM1突变伴FLT3-ITD阳性AML中观察到所有FLT3与NPM1基因型组合，以及互斥存在的不同长度FLT3-ITD插入，这些特征无法通过批量VAF推断。Miles等利用Mission Bio Tapestri平台对123例患者样本进行单细胞DNA测序联合免疫表型分析，发现AML由少数优势克隆主导，信号通路基因突变多位于不同亚克隆，极少共现于同一克隆，仅特定突变组合（如NPM1:FLT3-ITD、DNMT3A:IDH2）可促进克隆扩增，且MAPK/ERK通路突变与成熟髓系标志CD11b高表达相关。Morita等的平行研究纳入123例患者，观察到线性、分支及趋同演化等多种克隆演化模式，明确了NPM1与IDH突变与CD34、HLA-DR低表达相关，TP53突变与CD34高表达相关，且同一患者的免疫表型谱与突变获得顺序相关，还证实了TP53与PPM1D突变的互斥性（更符合DNA损伤应答通路的功能冗余逻辑）。Schwede等对207例患者的Tapestri平台单细胞DNA测序数据进行荟萃分析，证实表观调控相关突变通常早于信号通路突变，但也存在信号通路突变先发生的少见情况，后者多表现为外周血白细胞计数更高、信号通路突变纯合及患者年龄更低，且信号通路突变更易在已携带NPM1突变与表观调控突变的克隆中获得，提示适应性优势。后续研究还针对NPM1、IDH、TP53、PTPN11、BRAF等特定突变亚型开展单细胞多组学与结构变异检测，如在复杂核型AML中鉴定出单克隆、线性与分支多克隆三种演化模式，明确了遗传演化与细胞类型可塑性均为耐药机制。
综上，初诊阶段的单细胞测序可明确突变获得顺序、优化基因型-表型关联，潜在提升风险分层准确性，还可指导靶向治疗的优先级排序与序贯策略——若两种可靶向突变位于同一克隆，单药可能清除所有突变克隆；若突变先后发生于不同克隆，则需考虑联合用药以覆盖更多亚克隆。
空间多组学——炎症与肿瘤微环境
现有髓系肿瘤病理技术对骨髓结构与肿瘤微环境的表征不完整，空间技术可原位同步分析蛋白或RNA表达分布，解析恶性细胞与微环境的互作。Nachman等开发的全切片多重免疫荧光成像与单细胞免疫分型平台，在骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome, MDS）中鉴定出骨髓祖细胞组成与空间模式异常、红系拓扑结构紊乱、干/祖细胞从血管旁 niche 移位等特征，构建的MDS微结构扰动评分（MDS microarchitectural perturbation score, MDS-MAPS）比原始细胞比例更准确地区分缓解与活动性疾病，优于突变指标对低原始细胞计数MDS与意义未明的克隆性血细胞减少症（clonal cytopenias of uncertain significance, CCUS）的鉴别效能。
AML的肿瘤微环境研究具有重要临床意义——尽管骨髓免疫丰富，免疫疗法在AML中疗效有限，且多项scRNAseq研究证实AML存在促克隆演化与微环境重塑的炎症状态。近期一项免疫治疗临床试验（帕博利珠单抗联合地西他滨）结合空间转录组与scRNAseq，证实治疗后白血病细胞周围全局与局部免疫细胞富集，配体-受体分析揭示了白血病与免疫细胞间信号通路的特异性改变。另有研究通过空间蛋白质组学在AML骨髓中鉴定出三级淋巴结构（tertiary-lymphoid structure, TLS）样聚集体，并通过空间转录组验证，探索性分析显示TLS存在与患者生存改善相关，其功能意义仍需进一步验证。还有研究结合Visium阵列空间转录组与GeoMX数字空间分析，构建了髓内与髓外AML的空间转录组图谱，描述了不同AML亚群成熟状态下与骨髓微环境 niche 交织的炎症通路特征。
单细胞测序在MRD评估中的应用
AML诱导治疗初始缓解率高，但复发仍是治愈的主要障碍，完全缓解（complete remission, CR）期的MRD检测已成为关键的预后指标，反映驱动复发的耐药白血病细胞池。现有MRD检测技术各有局限：多参数流式细胞术（multiparameter flow cytometry, MFC）灵敏度仅为0.01%-0.1%，且难以区分诱导后恢复骨髓中的再生前体与残留白血病原始细胞；基于诊断期突变的批量NGS无法区分残留白血病与背景CH，而后者与即将发生的复发无关；靶向实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）灵敏度可达0.001%-0.01%，但仅适用于已知突变与融合基因，仅覆盖40%-50%的患者，欧洲白血病网AML MRD工作组（European LeukemiaNet AML MRD Working Party, ELN-DAVID）2024年指南推荐对Mut-NPM1、RUNX1::RUNX1T1、CBFB::MYH11、PML::RARα、KMT2A::MLLT3等融合基因采用qPCR监测，FLT3-ITD及其他突变优先采用超高灵敏度NGS（ultra-high sensitivity NGS, UH-NGS）。
单细胞测序有望突破上述局限：Ediriwickrema等利用覆盖19个反复突变基因的Tapestri面板对14例诱导后达CR的初诊AML患者进行检测，发现缓解期携带多个变异的克隆持续存在与复发风险升高相关，且克隆复杂性越高，标准化疗清除所有恶性克隆的效果越差。Dillon等通过单细胞DNA+蛋白联检，在3例患者中成功区分缓解期的残留AML与CH，其表面免疫表型分布与MFC结果一致。Robinson等进一步优化了单细胞蛋白基因组（DNA+蛋白）分析的通量，通过流式分选富集CD34?/CD117?幼稚区室细胞，将突变检测灵敏度提升至0.01%，并对30例诱导后骨髓样本进行分析，与批量NGS的总体一致率为76.7%，单细胞测序额外检出17个批量NGS未报告的突变，批量NGS检出16个单细胞测序未检出的突变（可能与单细胞测序预分选的细胞区室局限有关）。该研究证实单细胞分子谱可检测ELN-DAVID推荐的NPM1、FLT3-ITD等监测靶点，但癌基因融合检测仍受限于断点序列异质性与scRNAseq的3’/5’端测序流程，目前仅有个案报道可从scRNAseq数据中检出癌基因融合，其在AML常见融合（如RUNX1::RUNX1T1、KMT2A::MLLT3）MRD监测中的应用仍需验证。
优化MRD检测可提升风险分层准确性，指导治疗升阶或降阶，平衡复发风险与治疗毒性。Stahl等的研究显示，基线单细胞DNA测序测得的克隆数量越低，患者越易达MRD阴性，而突变负荷与MRD状态无关，提示批量测序无法替代克隆复杂性评估。此外，克隆结构随时间的变化也具有预后价值：NPM1突变AML复发时的克隆多样性越高，患者总生存越差。目前单细胞测序用于MRD检测仍受限于靶基因panel较小、等位基因丢失、流程复杂（需流式分选、单细胞DNA测序、抗体染色）等问题，需进一步简化以推向临床应用。
治疗选择性压力下的克隆演化
单细胞测序技术已广泛应用于难治/复发（refractory/relapsed, R/R）AML的克隆演化研究。Miles等与Morita等的单细胞DNA+蛋白研究均纳入了纵向样本，证实IDH突变克隆（对维奈克拉敏感）多富集CD34?原始表型，而维奈克拉耐药的RAS突变常表达单核细胞抗原CD11b；Morita等还发现FLT3与IDH2抑制剂治疗压力下，克隆多样性的白血病起始细胞池是耐药亚克隆涌现与筛选的基础。scRNAseq也揭示了药物反应相关的细胞异质性：Zeng等利用1000余例AML的批量RNA测序数据，结合单细胞参考谱去卷积，将细胞异质性分为原始型、成熟型、粒-巨噬祖细胞（granulocyte macrophage progenitor, GMP）型与中间型四类，构建了连接遗传改变与白血病干细胞（LSC）特性的框架，发现原始型vs GMP轴预后价值显著（原始型层级患者预后更差），但不预测治疗反应，原始型vs成熟型轴可预测公开数据集中的体外药物敏感性，但临床认证检测LSC17无法捕获该轴的预后与预测价值。
强化疗
