体内连续CRISPR筛选鉴定Nf1缺失在长期造血中的克隆优势地位

《Blood Science》：Sequential in vivo CRISPR screens identify the clonal dominance of Nf1 loss in long-term hematopoiesis

　　

摘要：系统性探究长期造血干细胞（long-term hematopoietic stem cell, LT-HSC）功能遗传调控因子及其在恶性转化中的作用仍是一项核心挑战。研究人员开发并验证了一种连续体内CRISPR筛选平台（sequential in vivo CRISPR screening platform），其特征在于5个月重建期后具有高sgRNA回收率，并开创性地采用混合二次移植（pooled secondary transplantation）策略。该系统不仅能识别富集基因，还可模拟克隆演化动态。作为平台灵敏度的有力验证，研究人员使用聚焦转录因子文库进行筛选，鉴定出典型肿瘤抑制基因——Ⅰ型神经纤维瘤蛋白1（Neurofibromin 1, Nf1）为优势命中基因（dominant hit）。初次筛选再现了骨髓增殖状态；令人惊讶的是，二次移植筛选放大了该表型并导致恶性造血发生。因此，这一两步法为研究长期造血遗传驱动因子及血液恶性肿瘤演化动力学建立了强有力的范式。

论文解读：《Sequential in vivo CRISPR screens identify the clonal dominance of Nf1 loss in long-term hematopoiesis》

一、研究背景与意义

终身造血由稀有的长期造血干细胞（long-term hematopoietic stem cell, LT-HSC）维持，其具备自我更新与多系分化能力。造血干/祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cell, HSPC）功能失调可致骨髓衰竭或白血病。CRISPR-Cas9虽是功能基因组学强有力工具，但应用于原代HSPC面临两大瓶颈：一是真正评估HSC功能需长期（LT）体内重建，但文库sgRNA难以在长期重建后高比例回收；二是HSC数量稀少且多数筛选采用短期终点（仅反映短期祖细胞而非静息HSC）。此外，传统基因敲除模型无法捕捉克隆竞争与演化过程。为突破上述限制，研究人员开发了整合LT重建与混合二次移植的体内连续CRISPR筛选平台，并用已知肿瘤抑制基因Nf1（Neurofibromin 1）验证其检测致病克隆扩增及模拟恶性演进的能力。该论文发表于《Blood Science》。

二、主要关键技术方法

研究人员使用Rosa26-Cas9敲入转基因小鼠，分选c-Kit⁺HSPC；构建靶向349个转录因子（各3条sgRNA）及100条非靶向对照的小鼠转录因子慢病毒sgRNA文库（lentiviral sgRNA library, LVA，基于lentiGuide-Puro骨架改造含mPGK-Ametrine报告基因）。HSPC经慢病毒感染后经尾静脉移植入致死剂量照射（9 Gy）的同系C57BL/6受体小鼠实现长期造血重建。初次移植5个月后，取骨髓HSPC行池化二次移植入次级致死照射受体小鼠。移植后不同时间点监测外周血嵌合率与谱系分布；分选各造血亚群提取基因组DNA，通过两轮PCR扩增sgRNA区进行Illumina深度测序；利用MAGeCK（Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR-Cas9 Knockout）进行sgRNA计数与基因富集分析（Robust Rank Aggregation, RRA）。独立验证实验使用单sgNf1或sgControl转导Cas9 HSPC并行移植。对供体来源HSC行Bulk RNA-seq，用STAR比对、DESeq2做差异表达分析（differential expression analysis），clusterProfiler做GO与REACTOME富集分析，IGV可视化编辑位点indel。流式用NovoCyte/BDFACSAria分析，组织学用H&E染色。

三、研究结果

3.1. Optimized retroviral vectors achieve high initial transduction efficiency

用野生型小鼠HSPC测试逆转录病毒载体转导效率，经Lin^?去除或c-Kit⁺分选富集后，LKS⁺（Lin^?c-Kit⁺Sca-1⁺）及LKS^?亚群均获高转导效率（Ametrine阳性率高），证明两种富集方式均可高效将sgRNA导入HSPC初始群体。

3.2. Lineage^?and c-Kit⁺HSPCs are comparable donor cells for in vivo screening

将sgControl转导的Lin^?或c-Kit⁺HSPC移植受者，外周血供体细胞嵌合率>90%，8周时骨髓（bone marrow, BM）与脾脏细胞计数、嵌合率及谱系分布（B/T/髓系）无显著差异，故选用操作简便的c-Kit⁺分选用于后续实验。

3.3. LVAs enable sustained sgRNA expression for effective LT HSPC screening

逆转录病毒载体组的外周血sgRNA携带细胞比例在移植4周显著下降（因需有丝分裂进入核内且静息HSC未被有效转导，其未转导子代逐渐取代），而优化慢病毒载体（LVA，mPGK驱动Ametrine）在c-Kit⁺HSPC获高初始转导效率且移植后>8周sgRNA表达稳定，适合LT筛选。

3.4. High sgRNA recovery in HSPCs after LT reconstitution validates an effective in vivo screening system

野生型小鼠c-Kit⁺HSPC转导转录因子慢病毒文库并移植，5个月后在LKS⁺、CMP（common myeloid progenitor）、GMP（granulocyte/monocyte progenitor）、MEP（megakaryocyte/erythroid progenitor）四个亚群中sgRNA近完全回收，各亚群间sgRNA频率高度相关（Pearson相关性高），证实系统可实现LT功能筛选的高重现性与高文库覆盖率。

3.5. In vivo screening nominates Nf1 as the top-enriched candidate associated with myeloproliferative disease

Cas9 HSPC转导转录因子文库移植5个月后，MAGeCK RRA分析显示Nf1为最强正向富集基因（三个靶向sgNf1均>40倍富集），表明Nf1失活在LT竞争性体内环境中赋予强大克隆增殖优势，与既往Nf1失活致RAS信号失调及髓系肿瘤报道一致。

3.6. Nf1 deficiency drives myeloproliferative phenotype in vivo

单独sgNf1（vs sgControl）转导Cas9 HSPC移植：sgNf1组小鼠死亡率升高（10/14），存活者出现显著脾肿大（splenomegaly）、外周血与骨髓髓系（CD11b⁺）偏向性扩增、Lin^?c-Kit⁺Sca-1^?（LKS^?）祖细胞增多、肝组织髓外浸润。纵向流式示4周起髓系比例即高于对照且随时间增加。Bulk RNA-seq示sgNf1 HSC中静息维持因子Gfi1下调，淋巴定向基因（Flt3, Igkv, Ighv）下调，RAS通路相关基因（Rasgrf2, Rasd1, Prkcb）上调；GO富集示WNT信号、有丝分裂、髓系分化正向调控及淋巴细胞免疫负向调控，从转录层面支持Nf1缺失致髓系偏向增殖表型。

3.7. Secondary screening amplifies the malignant phenotype resulted from Nf1 deficiency

初次筛选受体BM细胞混合二次移植入次级致死照射受者：二级受者白细胞（WBC）显著升高（粒/单/嗜酸为主，淋巴减少），骨髓与外周出现大量未成熟原始细胞（Giemsa染色高核质比），sgRNA携带细胞比例升至~90%。二次筛选MAGeCK分析显示Nf1 sgRNA丰度较初筛进一步剧增并压倒性主导，证实Nf1缺失克隆在二次移植中被放大，模拟了从骨髓增殖向侵袭性恶性造血的疾病演进过程。

四、讨论与结论总结

既往体内HSPC筛选存在sgRNA回收率低（LaFleur等约500条/鼠；Shankar等<30%）、观察窗口短不能反映真正LT-HSC功能、为达初始覆盖需体外扩增多致应激相关基因偏倚等问题。本研究通过优化LVA并选用含即刻满足造血需求的c-Kit⁺群体（含下游祖细胞）作供体，既避免HSC过早增殖压力又实现>1000 sgRNA/鼠覆盖与5个月LT重建后近完全sgRNA回收。二次移植策略可放大致癌潜能并模拟克隆演化，属开创性设计。Nf1作为最强富集命中验证了平台灵敏度；同时亦提示强驱动突变可能掩盖弱效基因，未来筛选可排除已知强克隆扩增驱动基因以更好解析自我更新/谱系命运调控因子。

结论：研究人员建立并验证了一种整合LT重建与混合二次移植的强力体内CRISPR筛选平台，在保持>1000 sgRNA通量下实现LT重建后完整sgRNA回收与高重现性；以Nf1为基准证实系统可敏感捕获长期造血遗传调控因子并动态模拟血液恶性肿瘤逐步演进，为研究LT造血功能基因组学及恶性演化动力学提供了新范式，亦可拓展用于鉴定协同或序贯突变。