西非矮山羊(West African Dwarf Goat)与东弗里生绵羊(East Friesian Sheep)乳寡糖(Milk Oligosaccharides, MOs)谱及乳唾液酸化状态(Sialylation Status)分析

《ACS Omega》：Analysis of the Milk Oligosaccharides Spectrum and Sialylation Status of Milk from West African Dwarf Goat and East Friesian Sheep

　　

乳寡糖(Milk Oligosaccharides, MOs)可调节多种生理过程，包括肠道健康与病原体防御。然而，既往研究多集中于牛乳，对于其他常用于产奶的家畜（如山羊和绵羊）中MOs的结构多样性知之甚少。为此，研究人员采用液相色谱-质谱(LC–MS)技术表征西非矮山羊与东弗里生绵羊乳中的MOs。分析结果显示存在大量具生物活性的MOs，共检出40种不同的MO结构。有趣的是，绵羊中所有检出的MOs亦存在于山羊乳中。鉴于唾液酸化MOs(Sialylated MOs)对哺乳动物幼崽肠道健康与病原体防御具有重要功能，研究人员同时采用高效液相色谱(HPLC)法定量了MOs结合的总唾液酸浓度——包括N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac)与N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid, Neu5Gc)及二者比值。东弗里生绵羊MOs中以Neu5Gc为优势唾液酸，Neu5Ac仅微量存在；而西非矮山羊乳中两种唾液酸分布较均衡。所得结果不仅对畜禽育种优化具有重要意义，对人类亦有参考价值。值得注意的是Neu5Gc，其摄入被认为可在人体内诱发促炎效应。

论文解读：西非矮山羊与东弗里生绵羊乳寡糖谱及唾液酸化状态分析

本研究发表于《ACS Omega》。人乳寡糖(Human Milk Oligosaccharides, HMOs)及动物乳寡糖(Milk Oligosaccharides, MOs)已知可调节幼崽免疫系统成熟、促进有益肠道菌群定植并通过模拟上皮细胞糖萼(Glycocalyx)糖链 motif 阻断病原体吸附。然而已有研究集中于牛乳，山羊与绵羊乳中MOs的结构多样性、唾液酸组成特别是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)与N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)在不同品种小型反刍动物中的分布尚缺乏系统报道。东弗里生绵羊(East Friesian sheep)为高产乳用绵羊品种，西非矮山羊(West African Dwarf goat)兼具肉用与乳用价值，二者乳中MOs谱此前未见系统研究。此外人类因CMAH基因失活无法内源合成Neu5Gc，膳食来源的Neu5Gc可被掺入人糖蛋白并引发抗Neu5Gc抗体介导的炎症及潜在致癌风险，故明确家畜乳中Neu5Gc含量具营养学意义。研究人员因此采用LC–MS及HPLC技术对两品种成熟乳的MOs结构谱及MOs结合唾液酸组成进行定性鉴定与定量测定，并与已有文献进行比较分析。

主要关键技术方法

研究人员采集德国FBN研究所西非矮山羊(n=3)成熟乳及德国Vietschow牧场东弗里生绵羊(n=3)成熟乳。经脱脂后采用多孔石墨化碳(Porous Graphitized Carbon, PGC)固相萃取柱纯化MOs；部分样品经C₁₈Spin Column进一步去除脂质与蛋白。MOs结构经超高效液相色谱-轨道阱质谱(UHPLC-Orbitrap MS/MS)，采用HILIC柱分离，中性及岩藻糖基化MOs用正离子模式检测，唾液酸化MOs用负离子模式检测，并通过MS/MS碎片及GlycoWorkbench 2软件进行结构注释。MOs结合唾液酸经三氟乙酸(TFA)水解后，以1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(DMB)荧光衍生，用反相HPLC(RP-HPLC)分离检测Neu5Ac与Neu5Gc，以酮脱氧壬糖酸(KDN)为内标做标准曲线定量。统计采用Bonferroni多重比较检验。

3.1. MO Compositions in Goat and Sheep Milk（山羊与绵羊乳中MOs组成）

研究人员通过UHPLC-MS/MS从西非矮山羊乳中共鉴定出40种MO结构，东弗里生绵羊乳中鉴定出19种MO结构，绵羊中所有检出的MOs均存在于山羊乳中。按类别统计，西非矮山羊乳中中性非岩藻糖基化MOs占28%(11/40)，东弗里生绵羊占21%(4/19)，包括半乳糖基乳糖(Galactosyllactose, GL)、乳-N-新四糖/乳-N-四糖(Lacto-N-(neo)tetraose, LN(n)T/LNT)及乳-N-己糖(Lacto-N-hexaose, LNnH/LNH)等同分异构体。岩藻糖基化MOs在两物种中均较少，仅检出岩藻糖基乳糖(Fucosyllactose, FL, 2_0_1_0_0)及一个含岩藻糖组合(2_1_1_0_0)，表明小型反刍动物乳中岩藻糖基化程度低，不同于人乳。唾液酸化MOs为最丰富类别：东弗里生绵羊中13种唾液酸化MOs里9种为Neu5Gc单唾液酸化，且未检出Neu5Ac单唾液酸化双糖(Disialyllactose, DSL, 2_0_0_2_0)；西非矮山羊则含15种Neu5Ac-单唾液酸化、9种Neu5Gc-单唾液酸化及3种Neu5Ac/Neu5Gc杂合双唾液酸化结构(如hDSL及杂合双唾液酸三糖)，显示山羊乳唾液酸分布更均衡。通过商业标准品(3′-SL与6′-SL)及特征MS/MS碎片确认了部分唾液酸α2-3与α2-6键连方式。文献比对显示本研究验证的40种山羊MOs中33种曾被≥2篇文献报道，绵羊乳中16种MOs与既往5篇详述文献重叠，差异可能源于采样时期(初乳vs常乳)、品种及分析方法不同。

3.2. Sialic Acid Quantitation（唾液酸定量）

研究人员将PGC纯化并经C₁₈除脂蛋白后的MOs组分及全乳分别酸水解、DMB衍生后用HPLC荧光检测。结果显示：西非矮山羊乳MOs组分中Neu5Ac浓度为38.7 ng/μL，Neu5Gc为27.3 ng/μL，二者比例接近；东弗里生绵羊乳MOs组分中Neu5Ac仅2.6 ng/μL，Neu5Gc达58.1 ng/μL，MOs结合唾液酸中>90%为Neu5Gc。全乳总唾液酸中Neu5Gc占比趋势与MOs组分一致，符合既往文献，证实小型反刍动物相较大型反刍动物(牛、水牛)合成更多Neu5Gc-含MOs，且东弗里生绵羊尤为突出。

讨论与结论总结（翻译研究结论部分）

分析揭示西非矮山羊与东弗里生乳用绵羊乳中存在大量具生物活性的MOs，但二者存在显著差异。西非矮山羊乳中延伸有Neu5Gc与Neu5Ac的MO结构比例相近，而东弗里生绵羊唾液酸化MOs几乎完全以Neu5Gc为主。大型反刍动物(如水牛和奶牛)中含Neu5Gc的MOs仅为亚组分且含量极低；此外牛/水牛中典型的Neu5Ac-含MOs(如SLN或DSL)在东弗里生绵羊中仅以其Neu5Gc-同源形式存在。Neu5Ac向Neu5Gc的转化需额外能耗，小型反刍动物乳中高水平的Neu5Gc提示其对幼崽具重要生理功能——可能是为竞争性阻断主要利用Neu5Gc-糖链作为吸附位点的病原体入侵，或对幼崽肠道微生态有特殊底物作用，此假说尚需验证。从人类营养角度，食物来源的高比例Neu5Gc可诱发炎症反应——膳食Neu5Gc被掺入内皮细胞等糖萼后遭抗Neu5Gc抗体识别并攻击，该病理机制被认为参与慢性炎症及相关癌症发生，故部分研究建议限制含Neu5Gc食品摄入。本研究结果为畜禽育种优化及评估山羊/绵羊乳制品对人类健康的潜在影响提供了基础数据。