《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Multitechnological integration advances musculoskeletal regeneration: synergistic progress of organoids, 3D/4D bioprinting, single-cell omics and artificial intelligence
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肌肉骨骼系统损伤与退行性疾病的再生修复仍是重大临床挑战，传统单一模式技术难以复现天然肌肉骨骼组织的复杂结构与功能特征。近年来，类器官、3D/4D生物打印、单细胞组学及人工智能（AI）等前沿技术的快速发展，为解决这一长期难题提供了新机遇。本综述系统阐释这四项核心
肌肉骨骼系统损伤与退行性疾病的再生修复仍是重大临床挑战，传统单一模式技术难以复现天然肌肉骨骼组织的复杂结构与功能特征。近年来，类器官、3D/4D生物打印、单细胞组学及人工智能（AI）等前沿技术的快速发展，为解决这一长期难题提供了新机遇。本综述系统阐释这四项核心技术的整合如何驱动肌肉骨骼再生研究的进展：通过解析各技术的方法学细节与内在协同机制，研究人员总结了多技术融合在构建高仿生体外模型、实现组织工程构建体的精准动态制造、高分辨率解析组织发育与修复过程中的细胞异质性，以及优化数据驱动的个性化再生策略等方面的最新成果。研究人员进一步结合代表性实验证据与转化意义，明确区分了各项技术在体外与体内应用，并对过去5年的前沿研究进行了全面表格汇总。此外，本综述展望了该交叉领域的未来发展方向与关键挑战。
1 引言
肌肉骨骼组织由骨、软骨、骨骼肌与肌腱构成，是人体运动功能与结构支撑的核心。然而，损伤后的再生修复仍是临床实践中的重大难题。这些组织的再生受复杂的分子信号级联调控，其有序的炎症期、修复期与重塑期过程，是理性设计靶向治疗策略的关键。肌肉骨骼系统中，骨、肌腱与肌肉形成高度整合的多组织单元（如肩袖复合体），其损伤不仅导致患者严重发病，也给全球医疗系统带来巨大社会经济负担。尽管过去几十年组织工程与再生医学取得显著进展——通过结合生物材料、种子细胞与生物活性信号因子构建功能性组织替代物——传统方法仍难以精准复现天然肌肉骨骼组织的层级结构与动态微环境。例如，骨软骨缺损因成分、结构与生物力学功能的空间异质性，修复难度极高；而作为连接硬软组织独特梯度结构的腱-骨界面，损伤后有效愈合与功能再生同样面临巨大障碍。
近年来，一系列革命性技术的快速发展为突破上述瓶颈提供了新路径。类器官技术可生成高度仿生的三维体外微组织模型，复现天然组织的结构与功能特征，目前已广泛应用于肝脏、心脏、皮肤等器官的疾病建模、高通量药物筛选与再生医学研究。3D生物打印技术实现细胞与生物材料的精准空间组装，可构建具有复杂解剖形态的组织替代物；4D生物打印进一步引入时间维度，打印构建体可在外源或内源刺激下发生预设的形态与功能演化，更好地匹配组织再生过程中动态变化的生物微环境。单细胞组学技术（包括单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞表观组学、单细胞蛋白质组学）以前所未有的分辨率揭示再生过程中的细胞异质性与细胞命运转变轨迹，例如骨骼肌再生的单细胞研究已阐明基质细胞（如成纤维脂肪祖细胞）的异质性及其“虚拟”分泌组在细胞间通讯中的关键作用。人工智能则赋能海量多组学数据分析、预测建模与生物制造工艺优化，其机器学习算法已被广泛用于预测生物材料性能、优化3D生物打印参数、分析高内涵成像数据，甚至构建数字孪生模型以加速生物制造与药物开发流程。
值得注意的是，这四项技术并非孤立存在，其深度融合正催生肌肉骨骼再生的新型研究范式：模型构建（类器官/生物打印）→机制解析（单细胞/多组学）→精准制造（AI优化生物打印）→智能迭代（AI驱动设计与分析）的闭环工作流程，大幅加速了基础研究向临床应用的转化。例如，类器官与3D生物打印结合可产生生理相关性更强、结构可控性更高的组织模型；AI可整合多组学数据指导生物墨水配方与生物打印策略优化，实现个性化组织工程。尽管仍面临血管化、长期功能维持与临床转化等挑战，多技术融合为开发下一代再生疗法、恢复受损肌肉骨骼组织全生理功能提供了前所未有的机遇。本综述系统阐述四项关键技术的协同进展，深入解析其整合策略、在肌肉骨骼再生中的代表性应用及待解决的关键挑战，同时结合详细实验数据与标准化总结，明确区分各技术的体外/体内应用谱系与最新研究进展，为肌肉骨骼再生的转化研究提供严谨实用的参考。
2 类器官技术在肌肉骨骼再生建模中的应用
2.1 肌肉骨骼类器官的构建与生物学特征
肌肉骨骼类器官通常由多能干细胞或组织特异性祖细胞通过自组织或无引导培养构建，可复现骨、软骨、骨骼肌或腱-骨界面的复杂结构。不同亚型类器官采用组织特异性细胞来源、培养条件与支架策略：骨类器官主要源于人诱导多能干细胞（hiPSCs）、骨髓间充质干细胞（BMSCs）与骨膜祖细胞，培养体系需含成骨诱导培养基（补充β-甘油磷酸（5–10 mM）、抗坏血酸（50–100 μg/mL）与地塞米松（10–100 nM）），常通过超低附着板自聚集或明胶甲基丙烯酰（GelMA）/羟基磷灰石（HA）等生物材料支架实现三维培养；软骨类器官主要源于软骨祖细胞与hiPSCs，培养体系含转化生长因子-β3（TGF-β3，10 ng/mL）与骨形态发生蛋白-2（BMP-2，50 ng/mL），常通过悬滴或海藻酸盐凝胶微球培养以维持软骨细胞表型并避免肥大；骨骼肌类器官依赖人原代肌细胞、卫星细胞或hiPSC来源的成肌祖细胞，培养条件含2%马血清与成肌分化因子（如成肌分化1（MyoD）），通过无支架自组装或基质胶三维培养形成可收缩肌管；肌腱/韧带类器官采用真皮成纤维细胞或肌腱干/祖细胞（TSPCs），通过三阶段培养方案（扩增→刺激→成熟，含血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）与TGF-β1）与自组装细胞片形成具有分层细胞外基质（ECM）沉积的杆状构建体。
这些类器官可忠实复现天然组织的核心细胞类型、空间细胞组成、ECM成分与部分生理功能。源自患者来源iPSCs或原代细胞的患者特异性类器官保留了供体的遗传与病理特征，是个性化疾病建模的理想模型，例如成骨不全患者的骨类器官表现出矿化缺陷与胶原沉积异常，与患者体内病理表型一致。与传统二维细胞培养相比，类器官模型为药物筛选、疾病机制研究与发育生物学研究提供了更具生理相关性的平台，是传统二维培养与动物模型的重要补充，尤其患者特异性类器官有望建立肌肉骨骼疾病的个性化疾病模型并开发定制化再生疗法，推动治疗研发进程。
2.2 类器官作为生物墨水源与生物打印验证平台
类器官在基于生物打印的组织工程中发挥双重关键作用：首先作为高质量种子细胞来源，解离的类器官细胞可用于3D生物打印，确保打印构建体具备强再生潜力并维持正确细胞表型，解离细胞通常以1×106–5×106cells/mL密度与水凝胶生物墨水（如GelMA、海藻酸盐）混合，保留类器官细胞的组织特异性分化潜能。新兴生物制造策略将细胞聚集体、微组织与类器官作为“构建模块”用于构建更大组织或器官前体，为肌肉骨骼组织工程开辟了新路径，例如该策略已在血管化骨与分区关节软骨构建中得到广泛验证。同时，3D生物打印的复杂组织支架可作为类器官培养的仿生微环境，促进类器官成熟与功能化，形成打印-培养一体化工作流程：具有梯度孔径（200–800 μm）与力学性能的3D生物打印支架可模拟天然组织微环境，通过力学信号与空间引导促进肌肉骨骼类器官成熟。此外，类器官模型可用于验证生物打印构建体的生物相容性、诱导分化能力与长期功能表现，加速生物墨水配方与生物打印工艺的迭代优化，例如将生物打印骨软骨构建体与骨/软骨类器官共培养，评估其对组织特异性分化与ECM沉积的支持能力，进而优化生物墨水组成与打印参数。
2.3 肌肉骨骼类器官的体外与体内应用
肌肉骨骼类器官在体外研究与体内再生治疗中具有互补的应用场景。体外应用中，核心用途包括疾病建模、高通量药物筛选与机制研究：骨类器官已用于骨质疏松、骨肉瘤与成骨不全建模，可在细胞与分子水平研究发病机制；软骨类器官广泛用于骨关节炎（OA）药物筛选，已鉴定出抑制软骨细胞凋亡与ECM降解的新型小分子（SM04690）；骨骼肌类器官可复现杜氏肌营养不良（DMD）病理，用于验证外显子跳跃疗法的疗效。
体内应用中，类器官主要作为细胞递送系统与组织移植物用于再生修复：源自BMSCs的骨类器官植入大鼠颅骨缺损模型（直径5 mm）后，术后8周骨再生率达80%，显著高于细胞悬液组的30%；包裹于丝素蛋白水凝胶的软骨类器官植入兔膝OA模型后，12周时软骨厚度改善且OA严重程度评分降低；肌腱类器官植入大鼠跟腱缺损模型后，形成具有平行胶原纤维的成熟肌腱组织，机械强度恢复至天然肌腱的70%。值得注意的是，类器官的体内应用需结合生物材料载体以提高存活率与宿主组织整合能力，当前研究聚焦于开发可注射类器官-水凝胶复合材料以实现微创治疗。
3 3D与4D生物打印在复杂肌肉骨骼组织构建中的作用
3.1 3D生物打印实现肌肉骨骼组织的精准空间组装
3D生物打印通过精确控制细胞、生物材料与生物活性因子的空间分布，实现复杂组织结构的仿生构建，其核心原理是通过挤出式、光聚合式或喷墨式生物打印方法，将负载细胞的生物墨水（如水凝胶、脱细胞ECM）逐层沉积为预设的三维结构。三类主流生物打印方法在肌肉骨骼组织工程中具有差异化的技术参数与应用范围：挤出式生物打印是最广泛应用的方法，打印速度5–50 mm/s、喷嘴直径100–800 μm、生物墨水粘度要求10–106cP，适用于构建骨支架、肌肉组织等大体积构建体；光聚合式生物打印（如数字光处理（DLP）、立体光刻）可实现微米级分辨率（5–50 μm）、打印速度100–500 μm/s，采用低粘度光交联生物墨水（如GelMA、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）），适用于构建骨软骨界面、腱-骨连接等精细结构；喷墨式生物打印具有高打印速度（100–1000液滴/s）与低细胞损伤率（<5%），生物墨水粘度<10 cP，适用于细胞微阵列与血管网络的高通量打印。
作为3D生物打印的核心组分，生物墨水的材料性能、生物相容性、凝胶动力学与粘度是构建体生物/力学性能的关键设计参数。肌肉骨骼3D生物打印采用组织特异性生物墨水配方：骨组织生物墨水通常为天然聚合物（GelMA、胶原）与无机材料（HA、β-磷酸三钙（β-TCP））的复合水凝胶，压缩模量10–100 kPa；软骨生物墨水为软水凝胶（海藻酸盐、胶原），压缩模量1–10 kPa，补充成软骨因子（TGF-β3、BMP-2）；肌腱/韧带生物墨水为弹性水凝胶（纤维蛋白、丝素蛋白），拉伸模量50–500 kPa，以匹配天然组织力学性能；骨骼肌生物墨水为柔性水凝胶（基质胶、GelMA），杨氏模量0.5–5 kPa，以支持肌管形成与收缩。多材料生物打印技术可实现硬软组织的特性整合，忠实模拟天然肌肉骨骼组织的固有异质性，例如骨软骨构建体的多材料打印采用梯度生物墨水体系，骨相为HA/GelMA复合水凝胶、软骨相为胶原/GelMA水凝胶、界面相为混合水凝胶，实现从80 kPa（骨）到5 kPa（软骨）的无缝力学过渡。
3.2 4D生物打印引入动态形变与功能适配
4D生物打印是3D生物打印的革命性进阶：通过采用智能刺激响应生物材料，初始打印构建体可在特定生物或外部刺激下发生预设的形态与功能形变，从而在时间维度引入动态功能适配。4D生物打印构建体的动态形变机制基于刺激响应生物材料的相变或结构重排，可由物理（温度、光、机械力）、化学（pH、离子浓度）或生物（酶、生长因子）刺激触发：温敏生物材料（如聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）、明胶）在低临界溶液温度（LCST，32°C–37°C）发生溶胶-凝胶转变，实现构建体在体温下的收缩或自折叠；光敏生物材料（如偶氮苯修饰水凝胶、螺吡喃）在紫外/可见光照射下发生顺反异构，导致构建体膨胀或收缩；pH响应生物材料（如壳聚糖、聚丙烯酸）随pH变化（如损伤部位酸性微环境）改变电荷与水合状态，实现按需药物释放与构建体形变；酶响应生物材料（如肽修饰水凝胶）被损伤部位特异性酶（如基质金属蛋白酶（MMPs））降解，实现构建体重塑与宿主组织整合。
在肌肉骨骼再生中，这种动态特性对模拟天然组织的生理功能至关重要，例如骨骼肌收缩、肌腱应力响应，以及植入物在体内自适应匹配缺损几何形状以实现微创植入。4D生物打印参数根据刺激类型与形变目标优化：温敏自卷构建体采用GelMA与PNIPAM复合生物墨水，25°C打印、层高50 μm，37°C下自卷为直径500 μm的管状结构；光敏血管构建体采用偶氮苯修饰GelMA生物墨水，打印分辨率20 μm，450 nm可见光照射下扩张30%以促进血管长入。典型应用包括打印平铺构建体在体温下自卷为管状结构，用于构建神经导管或血管移植物，为修复脊髓损伤或血管损伤等复杂线性缺损提供新策略。通过合理编程设计生物墨水，还可实现时空可控的生物活性因子释放，例如适配体可编程生物墨水可时空调控血管内皮生长因子（VEGF）的呈递，在特定时空位置按需释放VEGF，精准引导微血管网络的形态发生、排列与组织，实现多尺度血管形态发生的4D调控。
3.3 3D/4D生物打印在肌肉骨骼再生中的体外与体内应用
3D/4D生物打印在肌肉骨骼再生中具有广泛的体外与体内应用，体外应用聚焦于仿生组织模型构建与药物筛选，体内应用聚焦于组织缺损修复与个性化植入物制备。体外应用中，3D生物打印的骨软骨、腱-骨与肌-腱界面模型已成为研究组织发育与疾病发病机制的重要工具，例如构建具有梯度软骨退变的3D生物打印OA模型，揭示了IL-1β调控软骨细胞MMP表达的关键作用；4D生物打印的动态肌肉模型可模拟电刺激下的骨骼肌收缩，用于筛选肌松剂与促肌生成药物，其体外药效与体内动物结果具有高度相关性（R2=0.92）。
体内应用中，3D/4D生物打印是构建个性化肌肉骨骼组织替代物与植入物的最具前景技术：3D生物打印HA/β-TCP复合骨支架修复兔股骨髁缺损（直径8 mm），术后12周骨再生率达90%，再生骨压缩强度达20 MPa，接近天然皮质骨；具有分区结构的3D生物打印软骨构建体植入山羊膝软骨缺损模型后，6个月时形成表达II型胶原的透明软骨；4D生物打印的自适应肌腱移植物采用丝素蛋白/PNIPAM复合水凝胶，植入大鼠肩袖撕裂模型后，在体温下自适应匹配缺损几何形状，10周时腱-骨整合率达85%。目前3D/4D生物打印的临床转化处于临床前与早期临床阶段，首例人体3D生物打印骨支架修复颅骨缺损试验已于2024年完成，术后6个月显示安全有效的骨再生。
4 单细胞组学解析肌肉骨骼再生中的细胞异质性与分子机制
4.1 解析肌肉骨骼组织发育与再生的细胞图谱
单细胞组学技术（尤其是scRNA-seq与单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq））以前所未有的分辨率揭示肌肉骨骼系统在发育、稳态、损伤与修复过程中的动态细胞景观。肌肉骨骼单细胞组学研究的工作流程包括六个核心步骤：（1）组织解离：胶原酶、胰蛋白酶等酶消化新鲜肌肉骨骼组织（骨、软骨、肌腱、肌肉）获得单细胞悬液，活力>80%；（2）单细胞捕获：采用微流控芯片（如10x Genomics Chromium）或液滴系统捕获单个细胞；（3）文库制备：单细胞RNA逆转录为cDNA并进行扩增用于scRNA-seq，或染色质片段化测序用于scATAC-seq；（4）测序：高通量测序，scRNA-seq每个细胞测序深度50,000–100,000 reads，scATAC-seq每个细胞20,000–50,000 reads；（5）数据预处理：质量控制（去除低质量细胞与双细胞）、归一化与降维（PCA、t-SNE、UMAP）；（6）生物信息学分析：细胞聚类、细胞类型注释、差异基因表达分析、细胞轨迹分析与基因调控网络（GRN）构建。这些技术可揭示传统批量组学掩盖的细胞异质性，为构建全面的人类肌肉骨骼细胞图谱提供核心工具。
例如，骨折愈合研究中，单细胞转录组分析描绘了骨折后免疫细胞与骨骼干/祖细胞（SSPCs）的协同响应，鉴定出具有序贯促炎、促修复与抗炎表型的巨噬细胞亚群，并揭示SSPCs在成软骨分化前经历促炎与抗炎成纤维细胞分化阶段；scATAC-seq进一步鉴定出调控SSPCs分化的转录因子（如Runx2、Sp7），揭示骨折愈合的表观遗传调控机制。肌腱病研究中，单细胞与空间转录组联合解析了肌腱病的单细胞水平病理进展：起始于炎症浸润，继而软骨化生，最终导致软骨内成骨，并鉴定出疾病组织特异性内皮细胞亚群与巨噬细胞作为潜在治疗靶点。这些研究共同表明，单细胞组学技术可精准鉴定驱动组织修复或发病机制的关键细胞亚群（如特异性骨祖细胞、促修复巨噬细胞），描绘其谱系分化轨迹与细胞状态转变的关键节点，为肌肉骨骼疾病的新靶点发现奠定坚实基础。
4.2 指导肌肉骨骼类器官与生物打印构建体的精准设计
单细胞组学生成的海量高分辨率数据集为设计高仿生肌肉骨骼类器官与优化3D生物打印策略提供了不可或缺的设计蓝图。单细胞组学数据通过定义最优细胞类型组成、细胞比例与旁分泌因子谱，指导肌肉骨骼类器官设计：例如，天然骨组织的scRNA-seq鉴定出占骨细胞5%的特异性SSPC亚群（CD271+CD146+），其对成骨至关重要，采用该亚群按5%比例构建的骨类器官矿化率较未分选BMSCs提高60%；天然软骨组织的scRNA-seq揭示软骨细胞与基质细胞的最优比例为9:1，按此比例构建的软骨类器官可稳定维持软骨细胞表型12周，而其他比例的类器官则出现肥大。这些数据可精准指导研究人员选择体外模型的合适细胞类型与最优比例，更忠实地模拟天然肌肉骨骼组织的体内复杂微环境状态。
在生物打印中，单细胞图谱数据优化生物墨水的细胞组成与空间打印模式，实现功能仿生：例如，腱-骨界面的scRNA-seq鉴定出梯度细胞分布（肌腱成纤维细胞→界面祖细胞→成骨细胞），按该梯度细胞分布多材料生物打印的腱-骨界面构建体，其机械整合效果较均匀细胞分布构建体提高70%；骨软骨界面的空间转录组揭示关键因子（如Sox9、Runx2）的基因表达梯度，按该梯度释放这些因子的3D生物打印骨软骨构建体，培养4周时形成无明显边界的无缝界面。此外，通过将生物打印/类器官培养组织的单细胞转录组与空间图谱同天然靶组织（如健康或疾病阶段组织）直接比较，可定量评估工程组织的成熟度、细胞类型组成准确性与基因表达模式保真度，这种基于单细胞组学的评估为组织制造工艺的闭环反馈与迭代优化提供了客观精准的指标，推动肌肉骨骼组织工程从经验驱动向数据驱动的设计范式转变。
4.3 单细胞组学在肌肉骨骼再生中的体外与体内应用
单细胞组学技术主要用于体外的机制研究、靶点发现与模型优化，其体内应用聚焦于临床诊断、预后评估与个性化治疗指导。体外应用中，scRNA-seq是构建肌肉骨骼细胞图谱的核心技术，已用于鉴定骨、软骨、肌腱与肌肉组织中的新型细胞亚群与关键调控因子；scATAC-seq用于解析肌肉骨骼组织发育的表观遗传调控网络，鉴定出Runx2作为骨形成的核心转录因子；单细胞组学还用于优化肌肉骨骼类器官与生物打印构建体。
体内应用中，单细胞组学通过提供高分辨率分子与细胞信息，正在变革肌肉骨骼疾病的临床诊断与治疗：OA患者外周血单核细胞（PBMCs）的scRNA-seq鉴定出特异性CD14+CD16+巨噬细胞亚群作为OA严重程度生物标志物，灵敏度85%、特异度80%；骨肉瘤组织的scRNA-seq鉴定出负责化疗耐药的癌干细胞亚群（CD133+ALDH+），针对该亚群的靶向治疗显著提高了临床前模型的化疗反应率；单细胞组学还可指导个性化再生治疗，例如对患者来源骨缺损组织进行scRNA-seq，鉴定出缺损中缺失的特定细胞亚群与旁分泌因子，采用这些因子构建的个性化骨类器官在自体植入中实现了更好的再生效果。
5 人工智能赋能多技术整合的全流程优化
5.1 数据处理、模式识别与机制预测
人工智能算法（尤其是机器学习与深度学习）凭借强大的数据处理与模式识别能力，已成为分析高维海量数据集（如单细胞组学数据）的核心工具。人工智能在肌肉骨骼再生数据分析中的工作流程包括四个核心步骤：（1）数据收集与预处理：整合多模态数据（单细胞组学、成像、生物材料、生物打印参数）并进行数据清洗（去除缺失值、归一化、特征选择）；（2）模型选择与训练：根据研究目标选择合适的AI算法（如图像分析用深度学习、回归分类用机器学习、GRN构建用图神经网络（GNNs））；（3）模型验证：采用交叉验证（k折）与独立测试集评估模型性能，指标包括准确率、精确率、召回率、R2与均方误差（MSE）；（4）模型部署与解释：将训练好的模型用于预测
