《Frontiers in Immunology》：Integrating bulk RNA-seq, Mendelian randomization and single-cell RNA-seq to elucidate the roles of lactate metabolism related markers-SLC25A4 and keratinocyte in the pathogenesis of psoriasis
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摘要背景：以糖酵解增强和乳酸积累为特征的异常代谢重编程可促进银屑病（PsO）的发病。然而，能够在因果层面连接线粒体功能障碍、免疫失调及角质形成细胞（KC）异常的乳酸代谢相关基因，在PsO中的定义仍不充分。本研究旨在鉴定稳健的乳酸代谢相关生物标志物及PsO新的治
摘要背景：以糖酵解增强和乳酸积累为特征的异常代谢重编程可促进银屑病（PsO）的发病。然而，能够在因果层面连接线粒体功能障碍、免疫失调及角质形成细胞（KC）异常的乳酸代谢相关基因，在PsO中的定义仍不充分。本研究旨在鉴定稳健的乳酸代谢相关生物标志物及PsO新的治疗靶点。
方法：研究人员整合批量RNA测序（RNA-seq）数据集与人工整理的乳酸相关基因集，以识别PsO中的差异表达乳酸相关基因（DE-LRGs）。进一步采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）、差异表达分析及双样本孟德尔随机化（MR），优先筛选与疾病具有因果关联的候选基因。随后应用机器学习算法识别稳健的诊断生物标志物，并构建人工神经网络（ANN）模型。研究还进行了功能富集分析、免疫浸润分析及免疫介质相关性分析。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据解析细胞类型特异性及KC亚群重塑情况，并采用免疫组织化学和体外实验对生物标志物进行验证。
结果：研究在PsO中共鉴定出23个DE-LRGs。整合网络分析与MR分析进一步确定了7个具有潜在因果相关性的DE-LRGs。机器学习方法最终筛选出3个稳健生物标志物——GOT2、PYGL和SLC25A4。ANN模型在独立队列中表现出优异的诊断性能（曲线下面积AUC > 0.90）。功能富集分析提示，这些标志物显著参与JAK–STAT信号通路及氨酰-tRNA生物合成。其表达水平与免疫细胞浸润显著相关，尤其与树突状细胞及静息肥大细胞，以及关键免疫介质密切相关。scRNA-seq分析显示，PsO中KC亚群发生显著重塑，表现为分化轨迹改变以及乳酸相关信号和细胞间通讯网络紊乱。SLC25A4在PsO中于批量和单细胞水平上均表现出一致性下调，且经免疫组织化学验证。在体外实验中，HaCaT细胞中SLC25A4敲低可降低细胞活力，并促进细胞凋亡。然而，本研究仍存在一定局限性，主要基于公共数据库和体外实验，尚缺乏动物模型验证；仍需通过多中心、前瞻性队列及体内实验进一步证实。
结论：本研究系统刻画了PsO中乳酸代谢相关基因的图谱，并鉴定SLC25A4为稳健的诊断生物标志物，提示靶向乳酸代谢，尤其是SLC25A4，作为PsO诊断和治疗策略具有转化应用潜力。
该论文发表于《Frontiers in Immunology》。研究围绕银屑病（PsO）的代谢重编程机制展开，聚焦乳酸代谢异常如何介导表皮细胞病理改变与免疫炎症失衡。银屑病目前已被认为不仅是局限于皮肤的慢性炎症性疾病，而且是由Th1/Th17轴、IL-17、TNF-α等共同驱动的系统性免疫介导性炎症性疾病。既往研究提示，PsO病灶中糖酵解增强、乳酸积聚以及线粒体代谢异常广泛存在，乳酸不仅是代谢终产物，也参与免疫调控、信号转导和蛋白质乳酰化等过程。尽管乳酸代谢在PsO中的作用逐渐受到重视，但哪些关键基因能够在因果层面连接线粒体功能障碍、免疫微环境失衡与角质形成细胞（KC，表皮主要结构细胞）异常，仍缺乏系统性界定。因此，开展本研究的核心目的，是从多组学和因果推断层面识别稳健的乳酸代谢相关标志物，并明确其在银屑病发病中的细胞学基础和潜在转化价值。
研究人员整合转录组学、遗传流行病学和单细胞转录组学证据，构建了由“差异分析—共表达网络—孟德尔随机化—机器学习—单细胞定位—实验验证”组成的完整研究框架。研究首先在公开数据库中整合银屑病皮肤组织转录组数据，并结合乳酸代谢相关基因集合，筛选出银屑病中的差异表达乳酸代谢相关基因；随后通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）锁定与疾病表型高度相关的模块，再利用双样本孟德尔随机化（MR）评估候选基因与PsO之间的因果关联；在此基础上，进一步借助LASSO、SVM-RFE及Boruta等机器学习方法筛选诊断标志物，并构建人工神经网络（ANN）模型验证诊断性能。最后，研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析关键基因的细胞类型特异性及角质形成细胞亚群变化，并以免疫组织化学和HaCaT细胞体外实验对核心标志物进行验证。研究结论表明，GOT2、PYGL和SLC25A4是银屑病中稳健的乳酸代谢相关标志物，其中SLC25A4表现出最稳定、最一致的跨平台下调特征，并与KC功能失衡及免疫激活密切相关，是潜在的诊断和治疗靶点。
本研究主要技术方法包括：整合GEO数据库4个皮肤组织批量转录组队列（GSE54456、GSE13355、GSE14905、GSE182740）及1个单细胞转录组队列（GSE220116）；基于MSigDB构建乳酸代谢相关基因集；采用WGCNA、差异表达分析和双样本MR筛选因果候选基因；以LASSO、SVM-RFE、Boruta和ANN评估诊断效能；利用CIBERSORT进行免疫浸润分析；通过Seurat、CellChat、monocle等方法完成单细胞分群、细胞通讯和拟时序分析；另纳入北京朝阳医院斑块型银屑病患者10例及健康对照10例进行免疫组织化学验证，并在HaCaT细胞中开展SLC25A4敲低实验。
3.1 鉴定银屑病中的23个差异表达乳酸代谢相关基因
研究首先在GSE54456队列中进行WGCNA分析，结果显示样本间不存在明显离群值，采用软阈值β=16建立无尺度网络后，共识别出10个共表达模块，其中MEblue模块与疾病表型相关性最强，包含3,208个银屑病相关模块基因。随后差异表达分析共获得7,612个银屑病差异基因，其中上调3,073个、下调4,539个。将银屑病差异基因、模块基因与350个乳酸代谢相关基因取交集后，最终得到23个差异表达乳酸代谢相关基因（DE-LRGs）。这一结果说明，银屑病中确实存在一组与疾病表型密切相关的乳酸代谢异常基因。
3.2 23个DE-LRGs的GO、KEGG和PPI分析
为明确上述23个基因的生物学功能，研究进行了功能富集和蛋白互作分析。结果显示，这些基因显著富集于53个GO条目和17条KEGG通路，涉及脱氧核糖核苷代谢、线粒体基质、维生素结合和核苷酸代谢等过程。PPI网络进一步揭示了PYGL-LDHA、GOT2-ACACB、SLC25A4-TK2等相互作用关系，提示这些候选基因主要参与线粒体能量代谢、糖原/糖酵解底物转运及代谢耦联过程。
3.3 鉴定银屑病中的7个枢纽基因
研究进一步采用双样本MR分析，评估23个DE-LRGs与PsO之间的因果关联。结果基于逆方差加权法（IVW）筛选出7个与PsO具有潜在因果关联的候选暴露因素：GOT2、PYGL、SLC25A4、C1QBP、LDHA、PLA2G6和KCNN4。其中LDHA为风险因素，而其余6个基因为保护因素。散点图、森林图、漏斗图以及异质性、水平多效性、逐一剔除和MR Steiger方向性检验均支持分析结果的稳定性与可靠性。因此，这7个基因被界定为后续研究的枢纽基因，表明乳酸代谢相关通路不仅与PsO相关，而且其中若干基因可能在遗传层面参与疾病发生。
3.4 鉴定银屑病中的3个生物标志物
在7个枢纽基因基础上，研究联合LASSO回归、支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）和Boruta算法进行特征筛选。三种方法交集得到3个特征基因：GOT2、PYGL和SLC25A4。随后在4个独立转录组队列中进行表达验证，发现GOT2和PYGL在PsO中上调，而SLC25A4下调，且差异方向一致。ROC曲线分析显示三者在训练集和验证集中均具有较高诊断价值，AUC均大于0.9，因此被确定为正式生物标志物。
3.5 3个生物标志物的ANN模型与生物学通路
研究基于GOT2、PYGL和SLC25A4构建ANN诊断模型，在GSE54456、GSE13355和GSE14905中均显示出优异的诊断性能，AUC均大于0.9，提示其具有良好的临床判别潜力。GSEA分析表明，3个标志物共同富集于JAK–STAT信号通路和氨酰-tRNA生物合成等关键通路。GeneMANIA构建的基因-基因相互作用网络显示，它们与20个相关基因存在联系，主要通过物理互作和共表达关系参与糖原代谢、葡聚糖代谢等过程。该部分结果表明，乳酸代谢相关标志物不仅具有诊断能力，而且可能通过经典炎症信号与基础能量代谢网络共同参与PsO病理过程。
3.6 生物标志物相关组织、基因与疾病预测
组织定位分析显示，在皮肤及相关组织中，GOT2和SLC25A4为中等表达，PYGL为低表达。相关性分析表明，SLC25A4与GOT2、PYGL呈显著负相关，而GOT2与PYGL呈显著正相关，反映出三者在病理状态下可能存在协同或拮抗性的代谢调控关系。疾病关联预测提示，SLC25A4、PYGL和GOT2主要与坏死和炎症等病理过程相关。
3.7 3个生物标志物相关免疫细胞与免疫因子
基于CIBERSORT的免疫浸润分析显示，PsO与对照组之间有14类免疫细胞存在显著差异。PsO中浆细胞、静息树突状细胞和静息肥大细胞浸润减少，而其他多数免疫细胞浸润增加，提示炎性免疫微环境发生广泛重塑。相关性分析发现，静息肥大细胞与SLC25A4呈强正相关，而与GOT2呈强负相关。CXCL1与PYGL、GOT2正相关，IDO1与GOT2正相关而与SLC25A4负相关；CXCR4、CXCR2、TAP2与GOT2正相关，TNFRSF9、CCR7、TAP2与SLC25A4负相关。研究据此认为，这3个标志物可能通过树突状细胞、肥大细胞及多类免疫介质共同参与PsO的炎症维持和免疫调节。
3.8 3个生物标志物的调控网络与药物预测
研究进一步从上游调控和潜在干预角度进行分析。结果预测出24个关键miRNA、5个lncRNA、5个circRNA以及21个转录因子（TF），提示GOT2、PYGL和SLC25A4嵌入复杂的非编码RNA和转录调控网络。药物预测获得28种与3个标志物相关的药物或分子化合物，其中包括甲氨蝶呤、地塞米松、烟酰胺、氯膦酸等。分子对接结果显示，GOT2与niclosamide、PYGL与asparagine、SLC25A4与clodronic acid具有较稳定结合能力。该结果说明，这些标志物不仅具有生物学意义，还具有一定药物可及性和转化开发潜力。
3.9 银屑病中角质形成细胞及其亚群的鉴定
单细胞层面上，研究对GSE220116进行质控后保留26,225个细胞，识别出8类主要细胞类型：KC、T细胞、NKT细胞、成熟树突状细胞、成纤维细胞、半成熟树突状细胞、黑素细胞和B细胞。细胞比例分析显示，PsO中KC总体比例显著下降。进一步发现，GOT2在T细胞和KC中差异表达，PYGL在KC中差异表达，SLC25A4在KC、T细胞和成纤维细胞中差异表达。由于KC既具有显著比例差异，又富集关键标志物表达，因此被确定为关键细胞群。研究进一步将KC重注释为4个亚群：KC-S.Corneum、KC-S.Basale、KC-S.Granulosum和KC-S.Spinosum。3个标志物，尤其是SLC25A4，在PsO中表达均显著降低，提示其与KC异常分化和表皮稳态破坏密切相关。
3.10 银屑病中KC的功能、细胞周期与细胞通讯
功能分析显示，PsO中KC不同亚群的富集通路与对照存在明显差异，尤其KC-S.Basale中与hepoxilins（HX）和trioxilins（TrX）合成相关通路被激活，提示脂质炎症介质代谢增强。细胞周期分析显示，对照组中KC-S.Spinosum和KC-S.Granulosum主要处于G2/M期，而PsO中这两类细胞更多停留于G1期，S期和G2/M期减少，反映其增殖状态改变。细胞通讯分析显示，对照组主要为T细胞与其他免疫细胞间通讯增强；而PsO组则表现为KC-KC、KC-B细胞及KC-半成熟树突状细胞间通讯更频繁且更强。KC亚群之间的网络在PsO中呈现极化特征，以KC-S.Basale和KC-S.Spinosum为主要通讯轴，KC-S.Granulosum相对减弱。MIF–（CD74+CD44）被鉴定为关键通讯信号，提示其可能参与异常表皮增殖与分化调控。
3.11 银屑病中KC的拟时序轨迹
为解析KC发育进程受影响的阶段，研究进行了拟时序分析。结果显示，对照组中KC分化轨迹由左向右推进，形成7个状态，KC-S.Granulosum和KC-S.Basale主要位于终末阶段；而PsO中KC分化方向相反，KC-S.Granulosum和KC-S.Basale主要位于早期阶段，提示其分化程序发生前移和重构。在对照组中，PYGL主要于晚期表达，GOT2和SLC25A4主要于中晚期表达；而在PsO中，SLC25A4主要于早中期表达，GOT2和PYGL主要于早期表达。该结果支持乳酸代谢重编程是KC异常分化的早期事件，并提示3个标志物可能参与角质形成细胞状态转换调节。
3.12 银屑病中T细胞和成纤维细胞亚群分析
在免疫和基质微环境层面，研究独立提取T细胞和成纤维细胞进行再分群。T细胞被划分为Th17细胞、CD8
+ T细胞和细胞毒性T细胞。尽管Th17细胞在两组中均占优势，但PsO中其比例下降，而CD8
+ T细胞明显扩增，并共表达TIGIT和LAG3等耗竭标志物，提示病灶中存在持续抗原刺激下的细胞毒性浸润增强。成纤维细胞则被注释为F2：Universal（Reticular）成纤维细胞、F5：Schwann-like成纤维细胞和F3：FRC-like成纤维细胞。PsO中F2亚群扩增，F3免疫调节型亚群减少，提示基质重塑可能削弱局部免疫稳态。这一结果说明，PsO病灶不仅存在KC异常，也伴随免疫与间质细胞组成的协同重塑。
3.13 实验验证
免疫组织化学结果显示，与健康对照相比，PsO组织中SLC25A4蛋白表达显著降低，PYGL也降低，而GOT2无显著差异。其中，SLC25A4的蛋白水平变化与转录组和单细胞结果最为一致，支持其为最稳健标志物。体外功能实验进一步表明，在HaCaT细胞中敲低SLC25A4后，细胞活力下降，EdU阳性细胞减少，凋亡率升高，说明SLC25A4对于角质形成细胞的存活和增殖具有重要作用。该结果直接支持SLC25A4功能缺失与KC稳态失衡相关。
讨论部分总结
讨论部分主要强调，本研究通过整合多层级数据，系统建立了乳酸代谢异常与银屑病发病之间的联系。其中，SLC25A4作为线粒体内膜ADP/ATP转运蛋白，在转录组、单细胞和蛋白水平上均表现出稳定下调，是连接线粒体功能障碍、免疫激活和KC异常的重要节点。研究指出，SLC25A4下调可能导致氧化磷酸化受损、活性氧（ROS）积累以及炎症放大，从而影响KC增殖—凋亡稳态。PYGL和GOT2虽然在转录水平上具有诊断价值，但其蛋白层面与转录层面存在一定不一致性，提示炎症微环境中可能存在转录后或翻译后调控。研究还总结了JAK–STAT信号、趋化因子网络、非编码RNA调控及细胞通讯轴在这些代谢标志物介导的病理过程中所起的作用。总体而言，论文认为乳酸代谢重编程并非银屑病的伴随现象，而可能是推动KC分化异常和免疫失衡的重要机制基础。
研究结论部分翻译
本研究鉴定出3个乳酸代谢相关基因——GOT2、PYGL和SLC25A4——可作为潜在生物标志物，连接PsO中的代谢重编程、免疫失调和角质形成细胞病理变化。其中，SLC25A4尤为关键：其在PsO中的下调与免疫激活相关，提示其可能在抑制炎症中发挥作用。从功能上看，SLC25A4对角质形成细胞增殖和存活至关重要，因为其敲低可诱导细胞凋亡。此外，SLC25A4参与JAK–STAT通路，嵌入以NEAT1/miR-23a-3p和GATA3为中心的调控网络，并具有与小分子（如clodronate）结合的成药潜力。因此，SLC25A4不仅可作为诊断标志物，还有望成为PsO代谢—免疫干预中的线粒体相关治疗靶点。
