《Chinese Medicine》：Ureic clearance granule ameliorates chronic kidney disease by reshaping microbial dysbiosis via modulating bile acid metabolism
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背景：慢性肾脏病（CKD）是一个高发的全球公共卫生问题，不可避免地导致肾衰竭。尽管肾素-血管紧张素系统阻滞剂作为一线治疗可以减少蛋白尿，但无法阻止其进展至终末期肾病（ESRD）。因此，迫切需要开发新的治疗策略。尿毒清颗粒（UCG）被广泛用于CKD患者，然而其治
背景：慢性肾脏病（CKD）是一个高发的全球公共卫生问题，不可避免地导致肾衰竭。尽管肾素-血管紧张素系统阻滞剂作为一线治疗可以减少蛋白尿，但无法阻止其进展至终末期肾病（ESRD）。因此，迫切需要开发新的治疗策略。尿毒清颗粒（UCG）被广泛用于CKD患者，然而其治疗CKD的潜在分子机制尚不清楚。
方法：研究人员分别使用宏基因组学和代谢组学分析了粪便肠道菌群和血清代谢物。并通过腺嘌呤诱导的CKD大鼠模型，检测了细胞外基质成分、Takeda G蛋白偶联受体5（TGR5）、胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）和核因子κB（NF-κB）p65的表达。
结果：UCG改善了腺嘌呤诱导的CKD大鼠的肾功能并减轻了肾纤维化。机制上，在CKD大鼠中，显著改变的肠道细菌（包括肝螺杆菌、溶血李生球菌、卵形拟杆菌、乳酸乳球菌、脆弱拟杆菌、费氏粪杆菌和直肠真杆菌）与血清肌酐水平表现出强烈的线性相关性。UCG治疗改善了这些肠道细菌的异常变化，表明UCG可以重塑肠道菌群失调。微生物衍生的代谢物是肠道菌群与宿主之间的桥梁。进一步分析显示，血清胆汁酸（包括熊去氧胆酸（UDCA）、牛磺去氧胆酸和猪去氧胆酸（HDCA））与CKD大鼠的血清肌酐水平强烈相关，且这些异常代谢物被UCG治疗逆转。值得注意的是，UDCA和HDCA与卵形拟杆菌、乳酸乳球菌、脆弱拟杆菌和直肠真杆菌均表现出强烈的线性相关性，表明UCG调节了微生物衍生的代谢物。此外，UCG治疗上调了CKD大鼠肾脏组织中TGR5、GLP-1R的蛋白表达，并下调了NF-κB p65蛋白表达，这表明UCG的肾脏保护作用与调节微生物失调、调控胆汁酸代谢以及改善TGR5、GLP-1R和NF-κB信号传导有关。
结论：本研究首次证明UCG通过重塑微生物失调和微生物衍生的胆汁酸代谢来改善CKD和肾纤维化。改变的肠道菌群和代谢物可作为评估UCG疗效的生物标志物。UCG可能通过调节微生物失调介导的胆汁酸代谢来增强TGR5、GLP-1R和NF-κB p65的表达，从而发挥其肾脏保护作用。
慢性肾脏病（CKD）是全球一项重大健康问题，影响约15-20%的成年人口。肾纤维化，尤其是小管间质纤维化，是几乎所有进行性CKD形式的共同最终病理结局。最终，患者不可避免地进展至终末期肾病（ESRD），需要肾脏替代治疗，如血液透析或肾移植。无论初始病因如何，小管间质纤维化均以成纤维细胞活化和增殖为肌成纤维细胞、细胞外基质（ECM）成分过度分泌和积聚以及正常肾小管进行性被取代为特征。机制上，越来越多的证据表明CKD与促纤维化分子通路的过度激活有关，包括肾素-血管紧张素系统、κB抑制剂/核因子κB（NF-κB）、TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin信号通路。肾素-血管紧张素系统阻滞剂被用作CKD患者的一线治疗和挽救性干预策略。这些药物可以有效改善肾功能并减少蛋白尿，但无法完全阻止CKD进展至ESRD。因此，目前没有有效的疗法能够阻止CKD的进展，开发新的治疗策略迫在眉睫。
宏基因组学和代谢组学等新兴技术进步使得能够从实验研究和患者队列中生成大规模数据集，促进了对疾病相关的基因型-表型连续体的探索。最近，一些开创性研究报告了CKD患者中 L. casei Zhang、Lactobacillus johnsonii (L. johnsonii)、Bacteroides fragilis (B. fragilis)、Bacteroides ovatus (B. ovatus) 和 Clostridium scindens (C. scindens) 的显著耗竭，补充这些益生菌可以有效改善肾功能并抑制肾纤维化。大量证据表明，肠道菌群衍生的代谢物是宿主与肠道菌群在多种难治性疾病中的多重中介。肠道菌群的变化伴随着内源性代谢物的失调，包括脂质（如多种胆汁酸和花生四烯酸分解产物）以及氨基酸及其衍生物（如由肠道菌群通过色氨酸代谢产生的吲哚-3-醛和吲哚-3-乳酸），这些物质促进了肾纤维化。最近的一项研究证明，在小鼠中，B. ovatus 通过增加产生HDCA的C. scindens的丰度，提高了肠道猪去氧胆酸（HDCA）的水平。HDCA通过上调Takeda G蛋白偶联受体5（TGR5）和下调法尼醇X受体（FXR）的表达，促进肠道内胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的表达。肾脏内GLP-1受体的激活可延缓CKD进展并减轻肾纤维化。此外，进一步证据表明HDCA通过直接上调肾脏内TGR5表达来改善肾纤维化。此外，L. johnsonii是一种能够通过色氨酸代谢生成吲哚-3-醛（IAld）的肠道菌株。在腺嘌呤诱导的CKD大鼠和CKD患者中，血清IAld水平的降低与肌酐水平呈强烈负相关。体内和体外研究均证明，IAld治疗通过抑制芳烃受体信号通路来减轻肾损伤。另外，CKD患者中观察到Faecalibacterium prausnitzii (F. prausnitzii) 的显著耗竭。补充F. prausnitzii改善了CKD小鼠的肾功能，减少了炎症和血清尿毒症毒素水平，重塑了肠道微生物生态并修复了肠道完整性；这些效应与F. prausnitzii衍生的丁酸盐介导的G蛋白偶联受体43信号有关。相反，在ESRD患者中，病原菌如Eggerthella lenta (E. lenta) 和 Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) 的相对丰度增加。在5/6肾切除CKD大鼠中补充E. lenta或F. nucleatum增加了血清尿毒症毒素水平并加剧了氧化应激、炎症、小管间质纤维化、肾小球硬化，以及血清肌酐和尿素水平的升高。进一步分析显示，E. lenta和F. nucleatum的相对丰度与血清尿毒症毒素水平呈正相关。代谢组学已广泛应用于CKD的生物标志物鉴定、疾病机制和药物治疗干预研究。这些发现表明，靶向肠道菌群和微生物衍生的代谢物是治疗CKD的有效策略。
了解疾病机制对于发现新型治疗药物至关重要。积累的临床证据证明了中医药（TCM）对CKD的有益效果。天然产物几个世纪以来一直被用于CKD的预防和治疗。越来越多的证据表明，天然产物，如5,6,7,8,3′,4′-六甲氧基黄酮、积雪草苷和新橙皮苷，分别通过增加L. johnsonii、B. fragilis和B. ovatus的丰度来改善肾纤维化。尿毒清颗粒（UCG）由美国食品药品监督管理局批准，是第一个专门为治疗CKD开发的中草药，并在中国临床应用已超过二十年。早期的几项随机、双盲、安慰剂对照、多中心临床试验证明，UCG安全有效地延缓了3b-4期CKD患者的疾病进展，在中度至重度肾功能不全患者中表现出长期疗效，并减轻了肾功能下降。最近的一项研究表明，长期使用UCG改善了血清肌酐变异性，并将CKD进展风险降低了39.8%。另一项研究报告称，UCG治疗增加了估计肾小球滤过率（eGFR），并降低了血清尿酸和血尿素氮水平，在CKD患者中分别在3、6、9、12和18个月时达到统计学显著性。迄今为止，很少有研究阐明UCG治疗CKD的潜在分子作用机制。几项初步研究证明，UCG通过抑制氧化应激和炎症、TGF-β1表达、晚期糖基化终末产物及其受体信号传导以及小管上皮-肌成纤维细胞转分化来改善小管间质纤维化和高血糖诱导的足细胞损伤。与依那普利相比，UCG通过促进ECM降解改善了慢性肾衰竭大鼠的肾功能和小管间质纤维化。这些发现表明，UCG对于中度至重度肾功能不全患者是一种有前景的替代疗法。
本研究中，研究人员首先利用腺嘌呤诱导的CKD大鼠模型，通过宏基因组分析鉴定了与UCG干预相关的显著改变的粪便细菌，以阐明肾功能与肠道菌群之间的关系。其次，通过非靶向代谢组学鉴定了与UCG干预相关的血清代谢物，以明确CKD大鼠中肾功能与微生物衍生代谢物之间的关联。第三，分析了与UCG干预相关的肠道细菌与肾功能相关代谢物之间的相关性，以鉴定与肠道菌群相关的代谢改变。最后，检测了肾脏内Takeda G蛋白偶联受体5（TGR5）、胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）和NF-κB p65的表达，以阐明UCG干预背后的微生物衍生代谢物介导的分子机制。本研究表明，UCG治疗改善了CKD并抑制了肾纤维化，这与通过调节肠道菌群衍生的代谢物，增强TGR5和GLP-1R的表达以及抑制NF-κB p65的表达有关。
研究使用腺嘌呤诱导的Sprague-Dawley大鼠CKD模型，主要采用了宏基因组测序和基于UPLC-HDMS的非靶向代谢组学分析方法，并通过蛋白质印迹法（Western blot）和免疫组化检测关键蛋白表达。实验分为对照组（CTL）、CKD模型组和UCG低、中、高剂量治疗组以及依那普利（ENA）阳性药物对照组。
结果显示，UCG改善了腺嘌呤诱导的CKD大鼠的肾功能并减轻了肾组织损伤。口服过量外源性腺嘌呤导致大鼠体重显著下降，尿量和肾脏重量指数显著增加。UCG中剂量（1.94 g/kg）治疗显著增加了体重，而UCG中、高剂量治疗显著减少了尿量和肾脏重量指数。与对照组大鼠相比，CKD大鼠血清肌酐、尿素和尿酸水平显著升高。UCG中、高剂量治疗显著降低了血清肌酐和尿素水平，三个剂量均显著降低了血清尿酸水平。组织学分析显示，过量腺嘌呤诱导了严重的肾内炎症细胞增殖、炎症浸润和小管间质纤维化，UCG治疗显著减轻了这些病理变化。
UCG治疗抑制了CKD大鼠ECM成分的表达。免疫组化分析显示，腺嘌呤诱导上调了肾组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，UCG治疗显著抑制了这一表达。蛋白质印迹结果显示，CKD大鼠肾组织中促纤维化标志物（α-SMA、I型胶原、纤连蛋白）的蛋白表达显著增加，而E-钙粘蛋白表达降低。UCG治疗显著降低了这些促纤维化蛋白的表达并保留了E-钙粘蛋白表达。
UCG治疗改善了腺嘌呤诱导的CKD大鼠的肠道微生物失调。宏基因组测序分析发现，CKD大鼠粪便肠道菌群结构和组成发生显著变化。主坐标分析（PCoA）显示CKD大鼠与对照组大鼠明显分离，而UCG治疗组位于两者之间。物种水平上，CKD大鼠中大多数细菌丰度降低，UCG干预抑制了这种丰度的下降，表明UCG改善了肠道菌群失调。
UCG治疗重塑了CKD大鼠脂质代谢相关的肠道微生物失调。在门水平，CKD大鼠厚壁菌门丰度显著降低，拟杆菌门丰度显著增加。在属水平，CKD大鼠拟杆菌和Duncaniella丰度显著增加，Dubosiella丰度显著降低。但UCG治疗并未显著改变这些主要菌群。火山图分析识别出大量显著改变的细菌类群，这些类群与脂质代谢密切相关。功能预测分析表明，脂质代谢，特别是次级胆汁酸生物合成，在CKD和UCG治疗中发挥关键作用。
UCG治疗雕刻了CKD大鼠胆汁酸代谢相关的肠道细菌。Spearman相关分析显示，70种显著改变的细菌的相对丰度与包括血清肌酐在内的9项临床参数相关。其中，卵形拟杆菌、费氏粪杆菌和直肠真杆菌的相对丰度与体重呈正相关，而与尿量、肾脏重量指数、肌酐、尿素、尿酸、总胆固醇和甘油三酯水平呈负相关。线性回归分析进一步显示，肝螺杆菌、溶血李生球菌、卵形拟杆菌、乳酸乳球菌、脆弱拟杆菌、费氏粪杆菌和直肠真杆菌等细菌与血清肌酐水平表现出强相关性（相关系数 > 0.80）。腺嘌呤诱导导致这些细菌丰度发生异常变化，而UCG治疗逆转了这些异常改变，其中多种细菌与胆汁酸的产生和代谢密切相关。
UCG的抗纤维化作用与CKD大鼠胆汁酸代谢谱的改变有关。血清代谢组学分析共鉴定出59种代谢物，主要包括胆汁酸、氨基酸等。稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）和聚类分析显示，这些代谢物能清晰区分三组大鼠。Z分数分析表明，大多数代谢物在CKD大鼠中显著升高，而在UCG治疗组中显著降低。偏相关网络分析显示，包括石胆酸（LCA）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）、牛磺去氧胆酸（TDCA）、甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）、熊去氧胆酸（UDCA）等胆汁酸之间存在强关联。
UCG治疗逆转了CKD大鼠异常的胆汁酸水平。KEGG代谢通路分析和富集分析证实，初级胆汁酸生物合成是本研究中变化最显著的通路。与对照组大鼠相比，CKD大鼠血清中多种初级胆汁酸（如TCDCA、TDCA、GCDCA、脱氧胆酸（DCA）、甘氨胆酸（GCA）、胆酸（CA）、牛磺胆酸（TCA））水平显著升高，而多种次级胆汁酸（如鹅去氧胆酸（CDCA）、LCA、UDCA、硫酸石胆酸（SCA）、猪去氧胆酸（HDCA））水平显著降低。UCG治疗逆转了这些异常变化，表明UCG改善了CKD大鼠的胆汁酸失调。sPLS-DA和层次聚类分析进一步确认了15种胆汁酸对三组大鼠的区分能力。
改变的胆汁酸作为UCG治疗CKD的潜在生物标志物。相关分析、线性回归分析和受试者工作特征（ROC）曲线分析表明，多种胆汁酸与包括血清肌酐在内的临床参数显著相关。线性回归分析显示，UDCA、TDCA和HDCA与血清肌酐水平的相关系数大于0.80。ROC曲线分析显示，包括CDCA、LCA、UDCA、TCDCA、TDCA、GCA、CDCA二硫酸盐在内的7种胆汁酸显示出较高的诊断效能（AUC = 0.900），其中UDCA表现最佳（AUC = 0.978）。这些结果表明UDCA、TDCA和HDCA可能作为预测UCG治疗CKD疗效的潜在生物标志物。
UCG通过调节胆汁酸代谢重塑微生物失调，从而减轻CKD大鼠的肾纤维化。网络热图和相关热图分析显示，UDCA和HDCA与包括肝螺杆菌、卵形拟杆菌、乳酸乳球菌、费氏粪杆菌、直肠真杆菌等在内的多种细菌表现出最强的相关性。线性回归分析进一步证实，卵形拟杆菌、乳酸乳球菌、费氏粪杆菌、直肠真杆菌和脆弱拟杆菌与UDCA和HDCA均表现出强线性相关性（相关系数 > 0.80），提示这些细菌可能产生这些代谢物。UCG治疗显著上调了受损肠道上皮屏障紧密连接蛋白（ZO-1、闭合蛋白、闭合小带蛋白-1）的表达。机制探索发现，UCG治疗显著上调了CKD大鼠肾脏组织中TGR5和GLP-1R的蛋白表达，并下调了NF-κB p65的蛋白表达。这些发现表明，UCG可能通过调节微生物失调介导的胆汁酸代谢，进而改善TGR5、GLP-1R和NF-κB信号传导，从而减轻CKD和肾纤维化。
讨论部分系统回顾了肠道菌群失调和微生物衍生代谢物（特别是胆汁酸）在CKD中的作用，并引用了大量文献支持本研究发现的临床相关性和机制合理性。例如，多项研究报道了CKD患者和动物模型中特定胆汁酸（如DCA、CDCA）水平的变化及其与疾病进展、心血管事件、死亡率等的关联。同时，讨论也证实了TGR5、GLP-1R等胆汁酸受体信号通路在肾脏疾病中的重要作用，并指出多种天然产物和中药方剂通过类似机制发挥肾脏保护作用。本研究首次将传统中药UCG的作用与现代肠道菌群-胆汁酸代谢轴理论相结合，为阐明其药效机制提供了新视角。
研究结论部分总结：本研究首次证明UCG通过重塑微生物失调和调节胆汁酸代谢来改善CKD和肾纤维化，这与TGR5、GLP-1R和NF-κB p65蛋白表达的改变相关。值得注意的是，UDCA和HDCA在CKD大鼠中与卵形拟杆菌、乳酸乳球菌、直肠真杆菌和脆弱拟杆菌表现出强烈的线性相关性。这些肠道细菌及其相关代谢物（包括UDCA和HDCA）可能作为预测UCG治疗CKD疗效的生物标志物。
