《Food Science & Nutrition》：Polyphenol-Rich Duhuo Jisheng Decoction Enhances Mesenchymal Stem Cell–Derived Exosome–Mediated Chondroprotection via PI3K/AKT Signaling in Osteoarthritis
编辑推荐：
骨关节炎（osteoarthritis，OA）作为一种典型的慢性退行性关节疾病，与慢性炎症及细胞存活失调密切相关。膳食多酚因其对慢性炎症性疾病的保护作用而受到广泛关注。独活寄生汤（Duhuo Jisheng Decoction，DHJST）是一种富含多酚的传统
骨关节炎（osteoarthritis，OA）作为一种典型的慢性退行性关节疾病，与慢性炎症及细胞存活失调密切相关。膳食多酚因其对慢性炎症性疾病的保护作用而受到广泛关注。独活寄生汤（Duhuo Jisheng Decoction，DHJST）是一种富含多酚的传统草药复方，广泛用于退行性关节疾病的治疗。本研究旨在探讨DHJST来源生物活性成分增强间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）来源外泌体软骨保护潜能的新机制。研究人员整合网络药理学与机器学习方法，鉴定DHJST中与AKT相关的核心靶点。采用含DHJST血清对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）进行预处理，以制备增强型外泌体（DHJST-Exos），并将其应用于IL-1β刺激的大鼠软骨细胞及胶原酶诱导的OA大鼠模型。通过炎症标志物、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）稳态及细胞凋亡实验评价其治疗效果，并采用PI3K/AKT抑制剂Rigosertib进行机制验证。网络药理学分析鉴定出DHJST中的关键生物活性多酚，包括汉黄芩素（wogonin）、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）及其他多酚样成分，这些成分可显著调控PI3K/AKT通路。DHJST-Exos可有效抑制TNF-α和IL-6，降低MMP-13和ADAMTS-5水平，并恢复COL2A1和Aggrecan表达。此外，DHJST-Exos通过调节Caspase-3/Bax/Bcl-2轴减轻软骨细胞凋亡。从机制上看，DHJST-Exos通过促进AKT磷酸化上调枢纽基因JUN和KDR的表达，而这种保护作用可被Rigosertib显著削弱。本研究表明，富含多酚的DHJST可通过激活AKT信号通路及其关键节点JUN和KDR，增强BMSC来源外泌体对OA的治疗效能。该协同策略将膳食生物活性成分与外泌体介导递送相结合，为慢性退行性关节疾病的管理提供了一种有前景的辅助干预途径。
该文发表于《Food Science》。研究聚焦于骨关节炎（osteoarthritis，OA）这一高发的慢性退行性关节疾病。OA的核心病理特征包括关节软骨进行性破坏、软骨下骨重塑以及滑膜炎症，最终导致疼痛、僵硬和活动受限。当前临床治疗主要依赖关节置换、软骨修复、康复训练和止痛等综合措施，但对疾病进展的生物学逆转能力有限。近年来，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）及其来源外泌体因具有旁分泌调节、抗炎和抗凋亡作用，被视为OA干预的重要新方向。然而，现有外泌体治疗仍面临效能提升机制不清、作用靶点不明以及如何增强软骨保护能力等问题。因此，探索能够优化BMSC来源外泌体生物活性的干预策略，具有明确的理论意义和转化价值。
独活寄生汤（Duhuo Jisheng Decoction，DHJST）是临床常用于退行性关节疾病的传统复方，其含有槲皮素（quercetin）、汉黄芩素（wogonin）、山奈酚（kaempferol）等多酚类成分，具有抗炎、抗氧化及调控细胞存活相关通路的药理潜力。已有研究提示，DHJST对OA具有一定抗炎及软骨保护作用，同时可促进BMSC增殖与分化，但其是否能够通过“预处理”方式增强BMSC外泌体治疗OA的能力，仍缺乏直接证据。基于此，研究人员围绕PI3K/AKT信号通路展开研究，拟回答DHJST是否可通过增强BMSC来源外泌体的功能，进而改善OA软骨细胞炎症、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）失衡和凋亡的问题。
研究人员首先通过网络药理学与机器学习，从DHJST活性成分及其潜在靶点中筛选关键作用通路和核心分子，再结合体外IL-1β诱导的软骨细胞OA模型及体内胶原酶诱导的大鼠OA模型，对预处理外泌体的功能进行验证。结果显示，DHJST富含的多酚类活性成分主要作用于PI3K/AKT相关网络；以DHJST含药血清预处理BMSC后所得外泌体（DHJST-Exos）较普通BMSC-Exos表现出更强的抗炎、抗基质降解和抗凋亡能力；其作用机制与AKT磷酸化增强及JUN、KDR上调密切相关，且该保护作用可被AKT通路抑制剂Rigosertib显著削弱。研究由此证明，DHJST与BMSC外泌体结合形成了一种具有协同增效特征的干预策略，为OA等慢性退行性关节疾病的辅助治疗提供了新的实验依据。
在技术方法方面，研究主要采用四类关键手段：其一，基于TCMSP数据库开展网络药理学筛选、GO/KEGG富集分析，并结合GEO数据库中4个OA转录组数据集（GSE111357、GSE107308、GSE207881、GSE168505）进行差异表达分析与基因集变异分析（GSVA）；其二，应用Lasso回归与支持向量机（SVM）筛选AKT相关枢纽基因，并以分子对接验证DHJST活性成分与靶蛋白结合能力；其三，从大鼠原代BMSC分离培养并以DHJST含药血清预处理，制备外泌体，随后通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和流式细胞术进行鉴定；其四，在IL-1β诱导软骨细胞模型及胶原酶诱导OA大鼠模型中，结合ELISA、RT-qPCR、Western blot和免疫组织化学（IHC）评价炎症、ECM稳态、凋亡及PI3K/AKT机制变化。
3.1 Network Pharmacology Identifies PI3K-AKT as the Primary Target Pathway of DHJSD
研究人员从TCMSP数据库中筛得DHJST活性成分196个、对应靶基因281个，并通过网络构建显示15味药、活性成分与靶点之间存在复杂关联。进一步利用MCODE识别出3个核心网络簇，其中核心簇1包含71个基因。功能富集结果表明，该核心簇主要涉及化学刺激应答、细胞死亡调控等生物学过程，尤其显著富集于PI3K-AKT信号通路，同时还关联IL-17、TNF等免疫炎症通路。该部分结果说明，DHJST治疗OA的主要分子基础集中于细胞存活与炎症调控相关的PI3K-AKT信号轴。
3.2 DEGs in OA Cartilage Are Primarily Enriched in the PI3K-AKT and Immune-Related Pathways
通过OA软骨组织转录组分析，研究人员鉴定出1228个差异表达基因，其中下调1061个、上调167个。KEGG富集分析显示，这些差异基因显著富集于PI3K-AKT信号通路，与DHJST预测靶通路高度一致。GSVA进一步表明，在多个独立OA数据集中，AKT1介导信号持续受抑，而细胞死亡、线粒体自噬及自噬性死亡相关通路活性升高。GO分析则提示，这些差异基因还广泛涉及细胞因子产生调控、白细胞迁移、白细胞介导免疫、胶原相关ECM及细胞因子活性等过程。该部分说明，OA病变软骨存在明显的AKT信号受损与炎症-基质失衡并存现象。
3.3 Identification of 11 Hub Genes Associated With AKT Signaling via Machine Learning
为从AKT通路相关DHJST靶基因中锁定关键分子，研究人员对71个候选基因进行机器学习筛选。Lasso回归筛得10个特征基因，SVM筛得2个特征基因，二者交集形成11个枢纽基因模型，并在训练集和验证集中均表现出良好的OA判别能力。贡献度分析提示，KDR、JUN和IKBKB下调是驱动OA发生的重要因素。进一步结合成药性和口服生物利用度筛选出9个代表性多酚或多酚样小分子，包括槲皮素、汉黄芩素和山奈酚等。该结果为后续从“成分—靶点—通路”层面解释DHJST作用机制提供了核心分子依据。
3.4 Molecular Docking Confirms Strong Affinities Between DHJSD Bioactives and Core Hub Proteins
在分子对接层面，研究人员重点考察了JUN和KDR两个核心靶点。结果显示，9种代表性活性成分与KDR及JUN均具有较强结合能力，其中部分与KDR的结合能低于?7 kcal/mol，提示结合稳定。关键相互作用残基包括KDR的CYS-917、GLU-915及JUN的GLU-19、ARG-28等。相较之下，这些小分子与IKBKB和IL6的亲和力较弱。该部分结果支持DHJST中的核心多酚成分可能通过直接作用于KDR和JUN相关结构域，参与调节KDR-AKT-JUN保护信号轴。
3.5 DHJSD-Pretreated BMSC Exosomes Inhibit Chondrocyte Inflammation and Apoptosis In Vitro
研究人员首先对BMSC来源外泌体进行表征。TEM显示外泌体呈典型杯状或环状囊泡形态；NTA证实其粒径主要分布于30–150 nm；流式细胞术显示CD9、CD63、CD81等外泌体标志物高表达。随后在IL-1β诱导的OA软骨细胞模型中发现，DHJST-Exos可显著降低软骨细胞总凋亡率，且其抗凋亡效果优于普通BMSC-Exos。ELISA结果进一步证实，DHJST-Exos显著抑制TNF-α、IL-6分泌，降低MMP-13和ADAMTS-5水平，并恢复COL2A1与Aggrecan表达。该部分说明，经DHJST预处理后，BMSC外泌体在抑炎、保护ECM稳态和抗凋亡方面均获得增强。
3.6 DHJSD-Exos Activate the KDR-AKT-JUN Axis to Regulate Chondroprotective Signaling
结合前述生物信息学预测与分子对接结果，研究人员在OA软骨细胞中验证KDR-AKT-JUN信号轴。结果显示，OA状态下KDR、AKT1和JUN的mRNA及蛋白表达均明显下调；DHJST-Exos处理后，AKT磷酸化水平明显升高，KDR和JUN表达显著增加，而PI3K总量变化不明显。进一步检测凋亡相关分子发现，DHJST-Exos可下调促凋亡蛋白Caspase-3和Bax，上调抗凋亡蛋白Bcl-2。上述证据表明，DHJST-Exos主要通过激活KDR-AKT-JUN存活信号级联，从而实现对软骨细胞的保护。
3.7 In Vivo Validation and Mechanistic Reversal via AKT Inhibition
在胶原酶诱导的OA大鼠模型中，关节腔注射DHJST-Exos后，滑液及外周血中的TNF-α、IL-6、MMP-13和ADAMTS-5明显下降，而COL2A1和Aggrecan水平升高，提示炎症反应和基质降解均得到抑制。分子层面上，DHJST-Exos显著增强软骨组织中AKT磷酸化并上调JUN与KDR表达，与体外结果一致。更关键的是，联合应用PI3K/AKT抑制剂Rigosertib后，DHJST-Exos对凋亡抑制及Bcl-2/Bax比值维持的有益作用被显著削弱。该部分从体内层面证明，AKT信号激活是DHJST-Exos发挥软骨保护效应的关键机制。
综合讨论部分可见，研究人员将传统中药复方、多酚类膳食生物活性成分、干细胞外泌体和信号通路机制研究整合于同一框架下，较系统地揭示了DHJST增强BMSC来源外泌体治疗OA的生物学基础。论文强调，DHJST不仅本身具有抗炎和软骨保护活性，更重要的是，它可通过预处理BMSC改变外泌体功能，放大其对软骨细胞炎症、凋亡和ECM失衡的纠正作用。机制上，PI3K/AKT通路是这一协同效应的中心，JUN和KDR则是其中的重要功能节点。尤其是KDR-AKT-JUN轴的提出，将传统复方活性成分与现代细胞外囊泡治疗的作用机制进行了连接。论文同时指出研究局限，包括Rigosertib属于多激酶抑制剂、尚未进行JUN或KDR的基因功能缺失/获得实验，以及未直接定量外泌体中具体多酚成分含量，因此结论主要支持“相关性增强与机制倾向明确”，但对某些直接因果关系仍需进一步验证。
研究结论部分可译为：总之，本研究表明，来源于经独活寄生汤（DHJST）含药血清预处理骨髓间充质干细胞（BMSC）的外泌体，在骨关节炎性软骨细胞及软骨组织中表现出增强的抗炎和抗凋亡作用。这些软骨保护效应与KDR–AKT–JUN信号轴的协同激活密切相关，并且可被AKT通路的药理学抑制显著削弱。研究结果提示，采用富含多酚的DHJST膳食生物活性成分对BMSC进行预处理，能够有效提高其分泌外泌体的治疗潜能。这种将草药生物活性成分与外泌体介导递送相结合的协同策略，为慢性退行性关节疾病的临床管理提供了一种有前景的辅助干预途径，但仍有待大规模临床试验进一步验证。
