骨关节炎（OA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征是软骨逐渐退化、滑膜炎症和关节功能障碍[1]，[2]。除了与年龄相关的OA外，运动相关的骨关节炎已成为一个重要的亚型，尤其是在经常承受重复性机械负荷和高冲击运动的运动员中[3]。武术运动员经常经历剧烈的关节应力、快速的方向变化和重复性冲击，因此更容易发生早发性OA[4]，[5]。在这些人群中，慢性微创伤和累积的关节过度使用会加速关节微环境中的炎症反应，最终导致软骨退化和疾病进展[3]。因此，对炎症生物标志物的灵敏检测和动态监测对于高负荷运动人群的早期诊断、损伤评估和个性化干预具有重要意义。
炎症细胞因子和降解基质的酶，如白细胞介素（例如IL-6）、干扰素-γ（IFN-γ）和基质金属蛋白酶（例如MMP-3），在OA的发病机制和进展中起着关键作用[6]，[7]。这些生物标志物在疾病早期通常浓度较低，并表现出复杂的协同作用，而不是独立作用[8]。因此，准确评估OA需要能够同时检测多种炎症介质的灵敏检测策略。然而，当前的临床和实验室方法在满足这些要求方面仍存在显著限制。
酶联免疫吸附测定（ELISA）仍然是蛋白质生物标志物检测的金标准，因为它具有高特异性、稳健性和与临床工作流程的兼容性[9]。然而，传统的ELISA主要依赖于酶-底物反应来生成信号，这限制了其灵敏度和动态范围[10]，[11]。特别是，在OA早期阶段检测低丰度的细胞因子仍然具有挑战性。为了克服这些限制，已经开发了多种超灵敏的蛋白质检测策略，包括纳米粒子辅助和无酶免疫测定、电化学传感器、场效应晶体管传感器、基于核酸扩增的测定以及DNA辅助的CRISPR-Cas测定[12]，[13]，[14]。一些代表性方法，如用于复杂基质中C反应蛋白的无酶免疫测定和用于蛋白质检测的DNA辅助CRISPR-Cas12a荧光测定[15]，[16]，已经实现了与传统ELISA方法相当甚至更低的检测限。然而，许多这些平台需要专门的纳米材料制备、电极或表面工程、专用仪器、核酸扩增或非标准的测定格式，这可能限制了它们在常规生物分析中的广泛应用。因此，开发一种与标准ELISA工作流程兼容的灵敏蛋白质检测策略仍然非常有价值。
近年来，CRISPR-Cas系统由于其可编程性、高特异性和通过附带转切割活动的内在信号放大能力而成为生物传感的强大工具[17]，[18]。其中，基于Cas12a的平台通过与DNA触发的CRISPR激活结合蛋白质识别事件，广泛整合到免疫测定中，受益于Cas12a的强大DNA转切割能力及其与基于抗体的测定格式的兼容性[19]，[20]。基于Cas14的系统也因它们的紧凑尺寸和针对ssDNA的能力而受到关注[21]。然而，这些单效应CRISPR系统通常依赖于一层附带切割，一些报道的平台仍需要额外的核酸预扩增步骤，这可能增加测定的复杂性并限制操作效率[22]，[23]。
最近，研究表明Cas13a可以通过单链DNA（ssDNA）激活，使其应用范围超越了传统的RNA检测[24]。更重要的是，将Cas13a与CRISPR相关的RNase Csm6结合，可以实现串联核酸酶放大机制，其中ssDNA触发的Cas13a激活切割Csm6激活剂前体，生成次级激活剂，进而激活Csm6介导的报告基因切割[25]。与单效应CRISPR免疫测定相比，这种Cas13a-Csm6级联反应提供了额外的酶促放大层，从而在等温和无需核酸预扩增的条件下增强荧光输出和信噪比[26]，[27]。因此，Cas13a-Csm6级联反应为超灵敏蛋白质生物传感提供了一种有前景的策略。
受这些进展的启发，我们提出了一种基于ssDNA触发的Cas13a-Csm6级联反应的CRISPR增强型ELISA平台，用于超灵敏地检测与运动相关的OA相关的炎症生物标志物。在这种设计中，传统的夹心免疫测定构建在标准ELISA微孔板上，而检测抗体与触发ssDNA分子结合，这些分子作为Cas13a的激活剂。抗原结合后，局部的ssDNA激活Cas13a，随后切割Csm6激活剂前体，生成次级信号分子，从而启动Csm6介导的信号放大级联反应。这种设计能够在不需要目标扩增或复杂仪器的情况下，有效地将蛋白质识别事件转化为放大的核酸信号。
重要的是，与依赖探针编码或光谱分离的传统多重免疫测定不同，所提出的平台通过跨单个ELISA孔的空间分辨检测实现了良好的分析效果，允许在同一微孔板内并行定量多种生物标志物。这种高分辨率的检测策略保持了标准ELISA工作流程的简单性和兼容性，同时显著提高了分析灵敏度。
在这项工作中，我们证明了所提出的平台能够超灵敏地检测多种炎症生物标志物，包括IL-6、IFN-γ和MMP-3，具有每毫升低皮克的检测限、高特异性以及在复杂生物样本中的稳健性能。此外，我们将该系统应用于武术运动员的样本分析，揭示了与运动相关的OA相关的独特炎症特征。这些结果突显了这种CRISPR增强型ELISA策略在早期诊断、疾病监测和运动员人群个性化干预中的潜力。更广泛地说，这项工作为将基于CRISPR的信号放大与传统免疫测定相结合提供了一个多功能且可扩展的框架，为临床诊断和运动医学中的灵敏蛋白质检测提供了新的机会。
