《Molecular & Cellular Proteomics》：dia-PASEF Enables Rapid Profiling of the Human Secretome for Deeper Insights into Cellular Dynamics and Inflammatory Mechanisms
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蛋白质分泌是细胞协调和信号传导的基本机制，其失调可导致广泛的生理功能障碍和疾病。利用二级抗体读出的免疫测定法是当前测量分泌蛋白的金标准，具有高特异性和灵敏度，但依赖于预设的蛋白质面板，限制了新生物学机制的发现。研究人员提出了一种可扩展的基于质谱的工作流程，结合
蛋白质分泌是细胞协调和信号传导的基本机制，其失调可导致广泛的生理功能障碍和疾病。利用二级抗体读出的免疫测定法是当前测量分泌蛋白的金标准，具有高特异性和灵敏度，但依赖于预设的蛋白质面板，限制了新生物学机制的发现。研究人员提出了一种可扩展的基于质谱的工作流程，结合数据非依赖采集（DIA）、离子淌度（IM）和并行碎裂（PASEF），以实现分泌组的快速全局分析。使用具有转化相关性的人类iPSC来源巨噬细胞模型，该方法在不到15分钟的采集时间内稳健识别了超过900个蛋白质组，并在大样本集中表现出卓越的可重复性。研究人员应用该方法分析促炎表型，确认了关键细胞因子和趋化因子的稳健识别，同时揭示了靶向面板和细胞内蛋白质组中均缺失的非经典免疫反应。特别是，研究人员识别出由APOA1和PON1分泌标记的独特胆固醇外排特征，作为对结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis）的响应，这与感染期间发生的代谢重编程一致。此外，对巨噬细胞对脂多糖（LPS）响应的24小时时间剖面分析解析了动态分泌轨迹，区分了急性和慢性炎症状态。延长时间段便于观察不同的细胞因子依赖性分泌表型，其中早期分泌的TNF和IL-6启动下游信号级联反应，导致趋化因子（如CXCL10和CCL8）的延迟分泌。总体而言，这些发现建立了一个稳健、可扩展的全局分泌网络表征平台。除巨噬细胞生物学外，该工作流程在生物标志物发现、疾病进展机制研究和新型治疗干预评估中具有广泛适用性，为推进精准医学提供了有力工具。
**论文解读：dia-PASEF工作流程实现人类分泌组快速分析及其在炎症机制研究中的应用**
**研究背景**
蛋白质分泌是细胞协调和信号传导的核心过程，涉及细胞因子、生长因子、激素等众多分子，约占人类蛋白质组的20%。分泌组（secretome）的失调与癌症、炎症疾病等密切相关，因此准确检测和定量分泌蛋白对理解细胞行为、疾病机制及新药发现至关重要。当前金标准为基于抗体的免疫测定法（如酶联免疫吸附测定ELISA），虽具有高特异性和灵敏度，但依赖预设蛋白面板，需提前了解分析物，限制了新生物学机制的发现。质谱（MS）为基础的蛋白质组学虽能提供无偏的深度分析，但受限于通量和可扩展性。近年来，捕获离子淌度谱（TIMS）和平行累积串联碎裂（PASEF）技术显著提高了采集速度，而数据非依赖采集（DIA）进一步提升了覆盖广度。然而，这些技术在分泌组学（secretomics）中的应用仍属空白。本研究旨在开发并优化一种结合dia-PASEF的稳健工作流程，以快速、全面分析人类分泌组，并利用具有转化相关性的人iPSC来源巨噬细胞模型，深入探究炎症动态及细胞响应机制。论文发表在《Molecular》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用的主要关键技术包括：1）丙酮沉淀法从细胞上清中提取分泌蛋白，以去除高丰度血清蛋白干扰；2）使用S-Trap?进行蛋白质酶解（胰蛋白酶/LysC）制备肽段；3）基于Evosep One液相色谱系统与Bruker timsTOF Pro质谱仪联用，采用dia-PASEF采集模式，优化离子淌度窗口和隔离宽度（通过py_diAID工具）；4）使用DIA-NN（v1.8.1）进行数据分析，基于人类参考数据库（UniProt 2023）生成硅预测谱图库，以1%假发现率（FDR）过滤；5）统计采用方差稳定化归一化（VSN）和Limma批次校正，差异分析使用双样本t检验。样本来源为从EBiSC获取的四株人iPSC系（6732BQ M3:2等），经分化得到巨噬细胞。
**研究结果**
**方法开发与验证（Method development and validation）**
研究人员首先优化了工作流程：通过比较丙酮和甲醇-氯仿沉淀方法，发现丙酮沉淀回收蛋白质更多且更简易，细胞活力检测确认3小时低血清条件不影响细胞健康。评估不同Evosep梯度方法（30至300样本/天）后，确定100样本/天（SPD）方法在15分钟内识别超过1200个蛋白质组，平衡了深度与通量。使用TLR4抑制剂TAK-242验证药理效应，发现其可有效抑制LPS诱导的促炎细胞因子（如IL-6、TNF、IL-1β）分泌，并上调抗炎标志物（如MMP2、SERPINA家族），证明该平台能检测全局分泌变化及药理调控。
**并行蛋白质组与分泌组分析揭示M1极化动态（Parallel proteome and secretome analysis provides deeper insights into M1 polarization dynamics）**
研究人员用LPS、干扰素γ（IFNγ）、热灭活大肠杆菌（HKEB）、结核分枝杆菌（HKMtb）和金黄色葡萄球菌（HKSA）刺激iPSC来源巨噬细胞3小时，并行分析细胞内蛋白质组和分泌组。分泌组识别约1200个独特蛋白质，PCA显示刺激特异性聚类，HKMtb刺激形成独特簇，而IFNγ靠近M0基线。蛋白质组数据表现出显著供体变异，经Limma校正后样品才聚类为M0和M1组。比较关键细胞因子（TNF、IL-6）的细胞内外丰度，发现分泌组中折叠变化更高，反映分泌途径的高效性。通过PCA载荷图和UpSet分析，识别出HKMtb刺激特有的一组蛋白质，富集于胆固醇外排和转运途径（如APOA1、PON1），这与结核感染引起的代谢重编程（胆固醇积累）一致。
**与基于抗体方法的比较（Comparison to an antibody-based approach）**
研究人员将工作流程与Nomic Bio的nELISA（基于抗体的免疫测定）进行对比。nELISA从预设275个靶点的面板中识别59个蛋白质，其中34个与质谱方法重叠；未检测到的25个蛋白（如CCL5、IFNε等）因肽段特性或低丰度而未被质谱捕获。PCA显示，nELISA能区分M0和M1，但无法像质谱平台那样区分不同M1刺激（尤其是HKMtb的独特分泌特征），这归因于靶向面板的局限性。两种平台的折叠变化相关性良好（R
2较高），但nELISA的折叠变化更高，可能因其酶促放大效应。
**巨噬细胞对脂多糖响应的动力学分析（Kinetic profiling of macrophage responses to lipopolysaccharide）**
研究人员通过将标准培养基置换为Opti-MEM?进行1小时脉冲式采样，追踪LPS刺激下巨噬细胞在24小时内的实时分泌动态。共识别788个蛋白质组，其中216个通过ANOVA显著变化，分层聚类出4个不同的分泌模式簇：与受体酪氨酸激酶活性相关的蛋白逐步下降并平台期；与ATP代谢相关的蛋白先降后回升，反映急性炎症中氧化磷酸化向糖酵解的转变。关键细胞因子轨迹显示，TNF和IL-6在刺激后1小时内分泌，TNF在4小时后迅速恢复基线，而IL-6缓慢下降；IL-1β的细胞内外水平保持平稳；CXCL10在6小时后才出现分泌，符合其在慢性炎症中的作用。这些动态轨迹清晰区分了急性与慢性炎症状态。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，该工作流程成功解决了传统免疫测定法的局限，提供了无偏、高深度、高通量的分泌组分析平台。通过减少血清干扰、优化沉淀和梯度方法，实现了稳健的重复性（Pearson r > 0.9）。研究还揭示了HKMtb刺激特有的胆固醇外排特征，这一信号在nELISA面板中缺失，突出了质谱方法的发现能力。同时，分泌组数据相比蛋白质组数据表现出更低的供体变异性，表明炎症通路在遗传差异下保守。时间动态分析揭示了关键细胞因子和趋化因子的时序分泌模式，有助于理解炎症进展和治疗干预窗口。结论部分翻译如下：总之，本研究建立了一个稳健的dia-PASEF工作流程，用于快速、深入地表征人类分泌组，揭示了炎症分泌组的复杂性及巨噬细胞M1极化过程中分泌蛋白的全面视图。除巨噬细胞生物学应用外，该方法为跨疾病背景和药理调节下的分泌网络探究提供了一个可扩展、无偏的平台。通过实现全局高分辨率分泌组分析，dia-PASEF有潜力改变生物标志物发现，揭示疾病进展新机制，加速下一代精准医学的发展。
