综述：开花植物无融合生殖的基础——研究现状与展望

《Plant Reproduction》：Basis of apomixis in flowering plants – state of the art and research perspectives

　　

在大多数被子植物中，种子通过有性过程产生。一些被子植物进化出了一种替代性繁殖策略，称为无融合生殖（apomixis），该过程绕过了有性发育的关键步骤（即减数分裂和受精），产生与母本遗传上完全相同的后代。尽管研究已取得显著进展，但无融合生殖的进化起源和分子本质仍不明确。近期研究结果表明，无融合生殖可能源于有性发育途径的失调，这种失调由遗传和表观遗传修饰以及内源和外源的胁迫信号共同引发，导致有性发育特定阶段的改变或缺失。无融合生殖作为一种通过种子实现克隆繁殖的自然现象，是植物育种中极具潜力的理想性状，尤其在保持杂种优势（hybrid vigor）和优异表型的基因组合方面具有重要价值。然而，无融合生殖在主要作物中并不存在，因此研究项目聚焦于如何在有性繁殖的重要农业物种中导入、诱导或模拟无融合生殖。本综述概述了开花植物无融合生殖的研究历史、作用机制，并总结了最新且最具影响力的研究进展，这些进展可能为在有性繁殖作物中引入无融合生殖铺平道路。本文还提请读者关注无融合生殖早期过程中，胚珠内细胞通讯这一部分解释的问题，这涉及进入无融合生殖发育途径的细胞中细胞壁化学成分的变化。

### 引言
“无融合生殖”（apomixis）一词最初由Winkler（1908）引入，其含义非常宽泛，指所有不经过配子融合而产生新植物个体的无性繁殖方式，包括多种形式的营养繁殖（vegetative propagation）。尽管类似的现象在某些蕨类植物中也有发现，但该术语目前被限定为无配子生殖（agamospermy），即通过无性方式产生种子进行繁殖，从而产生与母本基因型相同的克隆后代。过去，无融合生殖类群被视为进化的终点，但当前对无融合生殖的理解清晰地突出了其在多倍体复合体多样化和被子植物进化中的重要作用。因此，实际上认为无融合生殖促进了生物学上的“不朽”（immortality）。无性种子形成最早由Smith（1841）在雌雄异株物种*Alchornea ilicifolia*（大戟科）中描述，他观察到引种至邱园的雌性植株在缺乏花粉供体的情况下仍能产生有功能的种子。针对无融合生殖物种的先驱性细胞胚胎学研究始于19世纪末20世纪初。当时的研究结果清楚地表明了高染色体数目、杂交起源与无融合生殖之间的关系。因此，除了遗传背景外，种间杂交和多倍体化被认为是无融合生殖的重要先决条件。20世纪40年代，无融合生殖的细胞学和遗传学基础研究快速发展。研究表明，无融合生殖作为显性性状遗传。现代分子生物学工具的应用使科学家能够鉴定出多个参与无融合生殖组分独立遗传控制的基因座。关于遗传基础、分子方面、表观遗传调控机制以及其他内源和外源因素影响的最新发现，已在一系列综述中进行了总结。大量文献也回顾了合成无融合生殖系统作为现代植物育种中克隆种子生产潜在工具的最新进展。

为全面理解无融合生殖种子形成的复杂性，本文首先向读者介绍被子植物种子形成的过程，从有性物种开始，然后描述不同类型无融合生殖的特征。我们阐述了当前关于无融合生殖遗传和分子基础的知识，并概述了当代的研究趋势。

### 被子植物胚珠中的有性过程
大多数被子植物通过有性繁殖产生种子。其生命周期在单倍体和二倍体世代之间交替，分别由减数分裂和配子融合启动。这两个世代都以多细胞生物形式存在，即二倍体孢子体世代和单倍体配子体世代。雌配子体（胚囊）在胚珠的珠心内发育，包括大孢子发生（megasporogenesis）和随后的大配子发生（megagametogenesis）两个步骤。考虑到发育模式的多样性，Polygonum型单孢子发育是被子植物中最常见的雌配子体发育模式。在这些开花植物的胚珠原基中，一个单生的孢原细胞分化，通常直接作为大孢子母细胞发挥作用。这个二倍体细胞经过减数分裂产生四个单倍体大孢子，其中三个通常发生程序性细胞死亡，而合点端（chalazal）的大孢子成为功能性大孢子。在大孢子母细胞及其衍生的大孢子细胞壁中暂时沉积胼胝质（callose）是该特定类型大孢子发生的内在特征。目前对胼胝质在大孢子发生和功能性大孢子选择中的作用的理解仍然有限。然而，据推测胼胝质可能充当分子过滤器，在从孢子体阶段向配子体阶段转换时选择性地调节细胞间通讯程序。在大配子发生过程中，功能性大孢子经历三次有丝分裂，不伴随胞质分裂，形成具有八个细胞核的胚囊。在大配子发生最终阶段，胚囊发生细胞化，分化出四种不同的细胞类型，并沿珠孔-合点轴适当排列。除了参与此过程的遗传因素外，植物激素生长素（auxin）是雌配子体细胞命运指定的关键信号分子。成熟的Polygonum型胚囊是一个具有极性的七细胞结构，由高度特化的细胞类型组成：珠孔极（micropylar）有一个卵细胞和两个助细胞（synergid），一个中央细胞最初包含两个单倍体极核（polar nuclei），后融合形成次生核（secondary nucleus），以及合点极有三个通常短暂存在的反足细胞（antipodal cell）。与反足细胞不同，助细胞对繁殖至关重要，因为它们控制着双受精过程的多个步骤，包括花粉管引导、花粉管在雌配子体中生长停滞、花粉管破裂以及精子细胞的迁移。在被子植物的受精过程中，花粉管将两个精子细胞送入其中一个助细胞，该助细胞在接受雄性配子后退化。随后，一个精子细胞与卵细胞融合，另一个与中央细胞融合，启动胚胎和胚乳的发育。持续存在的助细胞在中央细胞受精后不久即退化，其受精依赖性消除对于阻止多余花粉管从而防止多精入卵至关重要。

### 无融合生殖的种子形成途径
#### 配子体无融合生殖
根据无融合生殖谱系的起源，可分为两大类型：配子体无融合生殖（gametophytic apomixis）和孢子体无融合生殖（sporophytic apomixis），后者也称为不定胚生殖（adventitious embryony）。配子体无融合生殖涉及雌配子体发育途径的改变。在这种无融合生殖模式下，世代交替得以维持，但配子体和孢子体具有相同的倍性水平，因为减数分裂被省略或改变为不减数分裂。后者导致产生未减数的雌配子体，其中未减数分裂的卵细胞通过孤雌生殖（parthenogenesis）发育为母本胚胎。配子体无融合生殖中减数分裂的省略或失调通常被称为无减数分裂（apomeiosis）。绝大多数配子体无融合生殖植物是多倍体，只有少数属如*Boechera*（原*Arabis*）、*Paspalum*、*Ranunculus*在野生二倍体水平存在无融合生殖。配子体无融合生殖根据启动未减数雌配子体发育的细胞来源，细分为二倍体孢子生殖（diplospory）和无孢子生殖（apospory）。在二倍体孢子生殖中，雌配子体由大孢子母细胞通过修改的减数分裂发育而来，既不发生染色体重组也不发生数目减少，导致形成未减数的大孢子二分体（减数分裂型二倍体孢子生殖），或通过省略减数分裂并代之以有丝分裂（有丝分裂型二倍体孢子生殖）。有丝分裂型二倍体孢子生殖比减数分裂型更常见且分布更广。在无孢子生殖中，未减数的雌配子体由体细胞珠心细胞发育而来，该细胞获得了功能性大孢子的发育能力。在二倍体孢子生殖和无孢子生殖物种中，胚乳可以自发发育而不需要中央细胞受精（自主无融合生殖，autonomous apomixis），或者需要授粉和中央细胞受精才能发育（假配合无融合生殖，pseudogamous apomixis）。大多数无融合生殖植物（约90%）中央细胞受精仍是胚乳发育的前提。仅在少数无融合生殖分类群（主要来自菊科）中，胚乳是自主发育的。大多数无融合生殖植物，包括许多自主型，会产生减数或未减数的花粉。这表明控制无融合生殖的遗传因子可能通过雄配子传递，这对无融合生殖的建立和传播可能至关重要。然而，无融合生殖植物产生的花粉通常表现出活力和功能降低，这限制了其有效传递无融合生殖相关等位基因的能力。无融合生殖植物大多是兼性无融合生殖者（facultative apomict），它们保留了有性形成种子的能力，这导致了后代的遗传变异并促进了克隆多样性。

#### 孢子体无融合生殖
在孢子体无融合生殖中，一个或多个母本胚胎通过有丝分裂直接由胚珠的体细胞（通常来自珠心细胞，少数来自珠被细胞）形成，与常见的有性生殖过程并行。由于进一步发育和成熟中的不定胚依赖胚乳作为必需营养和生长信号的来源，它们随后进入受精的雌配子体。由孢子体无融合生殖产生的种子可能包含具有母本和合子基因型的多个胚胎，但不定胚在种子发育过程中通常比合胚胎更具竞争力。从分类学角度，孢子体无融合生殖是最广泛的无配子生殖形式，更常见于二倍体物种中，而配子体无融合生殖与多倍体强烈相关。不定胚生殖在热带植物中比温带植物更常见，主要存在于芸香科（Rutaceae）、兰科（Orchidaceae）、卫矛科（Celastraceae）和野牡丹科（Melastomataceae）的成员中。研究发现，一些经济上重要的植物（如柑橘属*Citrus*、芒果属*Mangifera*、藤黄属*Garcinia*、茶藨子属*Ribes*、甜菜属*Beta*及禾本科部分物种）中存在不定胚生殖。近年来，作为珠心胚研究模型系统的柑橘属，以及芒果*Mangifera indica*中的孢子体无融合生殖已在分子水平上得到广泛研究。

### 无融合生殖的分类学重要性
相对较少的被子植物物种能够通过无融合生殖产生种子；据估计，大约0.1%的被子植物类群存在此现象。大约2.3%的被子植物属包含无融合生殖物种，且没有完全无融合生殖的属。根据最新发现，无融合生殖已在32个目、74个科、299个属和超过400个物种中被记录。值得注意的是，迄今只有不到10%的被子植物物种通过细胞胚胎学技术进行过研究，因此不能排除随着研究进展，当前的无融合生殖分类群名单可能会扩大。同样，无融合生殖繁殖在单子叶植物和真双子叶植物的许多不相关科中都有报道，且在一些早期分化的被子植物代表中也发现了无融合生殖过程。因此，该性状的分布表明无融合生殖起源具有多系性（polyphyletic）模式。不同的无融合生殖繁殖模式在分类学上分散于开花植物中，且无融合生殖似乎在被子植物的进化过程中独立起源了许多次。三个物种丰富的科，即菊科（Asteraceae）、蔷薇科（Rosaceae）和禾本科（Poaceae），占据了已确认的具有配子体无融合生殖植物案例的75%。此外，它们的关键机制不同：菊科代表通常是二倍体孢子生殖型，而蔷薇科和禾本科的无融合生殖则主要是无孢子生殖型。相反，孢子体无融合生殖在芸香科、卫矛科和兰科中显著流行。然而，尚不清楚无融合生殖在某些被子植物科的聚集是由于其遗传或发育倾向性所致。

### 无融合生殖在植物育种中的重要性
有性繁殖的物种将其与特定性状相关的新基因组合（等位基因）传递给后代，导致后代表型变异；然而，由于遗传分离，优异基因型及相应表型在后续世代中丢失。在自然界中，除了营养繁殖外，通过无融合生殖繁殖可以实现母本理想基因型和表型的复制；因此，无融合生殖——作为一种通过种子实现克隆繁殖的自然过程——是植物育种中高度理想的性状。不幸的是，大多数无融合生殖植物是无关紧要的作物，且没有具有农业重要性的近缘种。尽管在一些现代作物的远缘亲属中发现了无融合生殖，但人类驯化这些物种的活动，包括野生品种间的多次杂交以及对某些基因型的选择，可能抑制了它们天然的无融合生殖能力。将无融合生殖引入有性繁殖的主要作物可能在经济和社会方面极其有益。农业生产使用的是两个遗传距离较远品系之间的杂交一代（F₁）后代，因为杂种优势（杂种活力）对作物产量具有高度有益效应。所得植物材料不能作为下一代F₂代的种子来源，因为由于遗传分离，后代将表现出显著变异。因此，无融合生殖具有保持F₁植物杂种优势的潜力，因为它允许将理想性状克隆许多代。可控地利用无融合生殖可带来直接益处，例如简化种子生产过程并大幅降低其成本，特别是对于作为杂交种种植的选定农艺重要植物基因型。工程化无融合生殖将允许固定决定有价值性状的优异基因型，包括抗病性或对不利环境条件的耐受性，这在全球气候变化持续进行的背景下备受期望。此外，可以避免与有性生殖相关的复杂性，如不亲和性障碍或复杂的授粉策略。无融合生殖技术和种子克隆将为营养繁殖植物（如马铃薯、木薯）提供附加值，通过产生无病材料，使其更易于储存和运输。此外，将无融合生殖引入作物将提供通过提供大量遗传材料池来进一步改良有用植物和创造适应当地环境条件品种的机会。值得注意的是，这仅是一些有前景的展望。也有观点认为，无融合生殖在植物育种中应用所带来的潜在经济和社会效益可能引发下一次“绿色革命”，标志着植物育种和种子生产新纪元的开启。过去十年尽管科学进步极大地提升了对无融合生殖的理解，但将无融合生殖技术应用于植物育种对植物生物技术而言仍然是一个挑战。

### 无融合生殖的遗传和分子基础
有性和无融合生殖发育代表紧密相关的途径，有迹象表明它们可能共享共同的分子调控特征。尽管借助先进分子工具的研究取得了惊人进展，但决定无融合生殖过程的机制尚未完全阐明。目前尚无单一假设能够解释所有与无融合生殖、其发生、进化和分子本质相关的经验证据。因此，采纳了三个假设来解释无融合生殖作为一种具有多个可行起源来源的复杂进化性状的遗传基础和起源：（i）无融合生殖是发育异步性（空间和时间上的基因表达失调）的结果，这些基因在有性发育途径中活跃，由杂交和/或多倍体化引起；（ii）无融合生殖是一种基于突变的异常现象，涉及一个简单或复杂的基因座，携带控制无减数分裂、孤雌生殖和受精非依赖性胚乳发育的基因；（iii）无融合生殖是一个古老的开关，对有性生殖具有多态性（polyphenic），通过表观遗传调控触发。

为研究天然形式的无融合生殖，已针对不同的模式物种开发了多个模型系统。它们包括单子叶植物中的*Brachiaria*、*Eragrostis*、*Panicum*、*Paspalum*、*Pennisetum/Cenchrus*、*Poa*、*Tripsacum*属的分类群，以及双子叶植物中的*Taraxacum*、*Pilosella*（原*Hieracium*亚属*Pilosella*）、*Hypericum*、*Erigeron*、*Ranunculus*和*Citrus*属的分类群。在所有研究过的物种中，无融合生殖已被证明是一种可遗传的性状。以无融合生殖植物为花粉供体与有性个体为母本进行杂交的遗传分析表明，无融合生殖作为显性性状遗传，且其组分（即无减数分裂、孤雌生殖和自主胚乳发育）可以解耦，这表明它们由独立的基因座控制。例如，*Erigeron annuus*中的无融合生殖由两个不连锁的显性基因座控制，一个控制二倍体孢子生殖（D），另一个（F）同时控制孤雌生殖和自主胚乳发育。类似地，在*Taraxacum officinale*中鉴定了两个独立基因座，一个控制二倍体孢子生殖（DIP），另一个控制孤雌生殖（PAR）。最近，从无融合生殖蒲公英*Taraxacum officinale*中分离出了单性生殖基因（PARTHENOGENESIS, PAR），并显示其编码一种带有EAR（乙烯响应元件结合因子相关两亲性抑制）基序的K2-2锌指结构域蛋白。在无融合生殖的*Pilosella*中，三个遗传组分参与无融合生殖种子形成：即缺失无减数分裂（LOSS OF APOMEIOSIS, LOA）基因座，它刺激无孢子生殖初始细胞（aposporous initial）的形成并抑制有性生殖；缺失单性生殖（LOSS OF PARTHENOGENESIS, LOP）基因座，它控制孤雌生殖和自主胚乳发育；以及第三个AutE基因座，对受精非依赖性胚乳形成至关重要。在二倍体水平表达无融合生殖的*Boechera*属中，无融合生殖连锁基因座（APOmixis Linked LOcus, APOLLO）是一个可能与雌性无减数分裂相关的遗传因子，其雄性对应物是非减数花粉粒发育2（Unreduced Pollen GRAin Development2, UPGRADE2）基因座。

在禾本科（Poaceae）的黍族（Paniceae）无融合生殖植物中，无减数分裂和孤雌生殖作为一个单一的孟德尔基因座一起遗传。例如，在无孢子生殖的*Cenchrus squamulatus*（同物异名*Pennisetum squamulatum*）中，无融合作为单个显性基因座分离。该基因座被称为无孢子生殖特异基因组区域（apospory specific genomic region, ASGR），即一个物理上较大、半合子（hemizygous）、非重组的染色体区域，包含多个PsASGR-BABY BOOM-like（PsASGR-BBML）基因拷贝。在有性繁殖的拟南芥和芸苔属植物中异位表达BBM或BBM样基因，导致种子苗上自发形成体细胞胚和子叶状结构。进一步研究表明，在芸苔*Brassica napus*、番茄*Solanum lycopersicon*和水稻*Oryza sativa*的卵细胞中异位表达BBM，可在无受精情况下诱导胚胎发育。与*Cenchrus/Pennisetum*物种类似，在禾本科另一种研究无融合生殖相关基因的典型模式属——雀稗属（*Paspalum*）中，无融合生殖性状与一个单一的非重组半合子基因组区域——无融合生殖控制区（Apomixis Controlling Region, ACR）相关。在*Paspalum notatum*中，与ACR物理连锁的一个基因PnTgs1-like，其在有性植物珠心细胞中的表达显著高于无孢子生殖植物，其下调表达与无融合生殖途径的启动相关。此外，在*Paspalum simplex*中，一个无融合生殖连锁序列与起始识别复合体（ORIGIN RECOGNITION COMPLEX, ORC）的3个亚基同源，推测其基因PsORC3a可能与有性繁殖的2（母本）:1（父本）典型基因组比例偏离的无融合生殖胚乳发育有关。

大量实验证据表明，无融合生殖基因座通常是半合子的，并与雌雄异株植物的Y染色体表现出诸多相似性，包括抑制重组、转座元件（transposable element）积累和基因退化。此外，柑橘属中孢子体无融合生殖的遗传与单个显性基因座的传递有关，CitRWP基因被鉴定为这些植物珠心多胚性的候选基因。该基因在其启动子区域插入了一个微型反向重复转座元件（Miniature Inverted-repeat Transposable Element, MITE），推测这种插入可能导致珠心细胞建立胚胎发育。最近，一项DNA甲基组分析揭示了多胚柑橘中CitRWP基因近端区域的MITE发生超甲基化，而在无MITE插入的单胚柑橘中，CitRWP启动子呈现低甲基化。这些发现表明，多胚柑橘中CitRWP基因表达的激活与MITE插入区域的DNA超甲基化有关。在芒果*Mangifera indica*中也描述了类似的多胚性机制，鉴定出MiRWP基因，并发现其启动子区域有特定插入，是CitRWP基因的直系同源基因。值得注意的是，在蒲公英和山柳菊*Pilosella piloselloides*的单性生殖基因上游区域也报道了MITE转座子插入，这表明可能存在平行进化（parallel evolution）。目前，越来越多的证据表明，除表观遗传调控途径外，其他相互关联的调控机制也很重要，包括细胞周期控制、蛋白质周转调控、信号转导途径和植物激素调节。最近，通过共线性分析，APO基因座被定位到弯叶画眉草*Eragrostis curvula*的参考基因组上，并鉴定出两个可能参与无减数分裂分子通路的基因。该研究表明，与无减数分裂连锁的SNP序列与E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligase）具有同源性，这是一种参与通过26S蛋白酶体进行泛素依赖性蛋白质降解的RING型蛋白。这种通路在植物的许多细胞和生理过程中起关键作用，例如植物激素信号转导、遗传重组和细胞周期进程。在无孢子生殖的山柳菊*Hieracium praelatum*的无孢子生殖初始细胞和无孢子生殖胚囊中，也观察到与泛素-蛋白酶体通路相关的同源基因表达增加。在有性和无融合生殖的二倍体*Boechera*种质的珠心细胞中，也发现了E3连接酶活性的差异，表明其在调节生殖系发育中的潜在重要性。最后，研究结果也表明不同环境胁迫条件与植物对有性/无融合生殖决定的相对响应之间存在潜在影响。增加氧化胁迫的非生物因子（如长光周期、干旱、高温、低温、饥饿、盐度和渗透胁迫）会增加兼性无融合生殖植物从无减数分裂向减数分裂转变的速率。因此，氧化胁迫介导了发育途径的改变，氧化还原稳态的改变可能作为有性发育的功能触发器。

### 当代无融合生殖研究趋势
迄今为止，通过从野生近缘种导入无融合生殖性状来引入作物的策略仅在有限程度上取得成功。合成无融合生殖（synthetic apomixis）利用生物技术改造有性过程以模拟无融合生殖模式，是另一种可行的替代方法。合成无融合生殖成功的关键在于三个步骤：（i）诱导无减数分裂（将减数分裂改造为类似有丝分裂的分裂）；（ii）单亲胚胎形成（孤雌生殖或受精后消除母本或父本基因组）；（iii）形成有活力的胚乳。合成无融合生殖可以有效利用基因编辑技术，特别是成簇规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）/CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated protein, cas）策略。在拟南芥中通过突变DYAD/SWITCH1基因诱导无减数分裂、在玉米中突变同源AMEIOTIC1（AM1）基因，以及特别是在拟南芥中创建的MiMe（Mitosis instead of Meiosis，有丝分裂替代减数分裂）基因型，是迈向工程化无融合生殖的关键步骤。拟南芥中的MiMe系统已被应用于产生未减数且未重组的克隆雄性和雌性配子，它结合了三个基因的突变：Atspo11-1（防止DNA双链断裂形成，从而消除重组和配对）、Atrec8（改变染色单体分离）和Atosd1（省略第二次减数分裂）。最初，似乎将MiMe技术应用于系统发育距离较远的双子叶植物（拟南芥）和单子叶植物（如谷物）将是一个挑战，但很快证明是可行的。通过突变OsREC8、OsOSD1和OsPAIR1（替代SPO11-1的另一个重组必需基因），MiMe系统已在水稻中开发成功。最近，MiMe系统已用于在三个番茄杂交基因型中产生未减数、克隆的配子。在这个特定的MiMe系统中，结合了SlSPO11-1、SlREC8和SlTAM（SLTARDY ASYNCHRONOUS MEIOSIS）的突变；通过MiMe杂交种的杂交，可以获得保持全基因组杂合性的四倍体后代。获得克隆后代的下一步是跳过受精或消除受精卵中的父本基因组。通过操纵着丝粒特异性组蛋白CENH3可以诱导基因组消除。此外，MATRILINEAL（MTL或MATL）/NOT LIKE DAD（NLD）基因的突变（编码一种花粉特异性patatin样磷脂酶A）可在玉米中触发单倍体诱导。在拟南芥中，将MiMe和dyad植物作为母本与GEM（由CENH3变体混合诱导的基因组消除）品系杂交，已产生克隆后代。此外，通过CRISPR/Cas9系统同时编辑OsPAIR1、OsREC8、OsOSD1和OsMTL，已成功将无融合生殖引入杂交水稻；所得的四重突变体被命名为Fix（杂种固定，Fixation of hybrids）。类似地，通过突变OsSPO11-1、OsREC8、OsOSD1和OsMATL创建的四重突变体AOP（无融合生殖后代生产者，Apomictic Offspring Producer）能够产生无融合生殖后代。通过将MiMe突变体与在卵细胞中表达BBM1（BABY BOOM1）相结合，也在水稻中获得了杂交克隆种子。最近，研究表明蒲公英PAR基因通过CRISPR/Cas9介导的诱变具有无性植物育种的潜力。该基因在有性作物生菜的卵细胞中异位表达，可在无受精情况下触发其分裂并发育出单倍体胚胎样结构。同样，在单作物谷子*Setaria italica*中也记录了PAR诱导的孤雌生殖。源自野生无融合生殖禾草*Pennisetum squamulatum*的PsASGR-BBML转基因，可以在有性珍珠粟、水稻、玉米和烟草中诱导孤雌生殖，导致单倍体植株的形成。最近关于豇豆的研究也表明VuBBML1基因在胚胎和胚乳形成中发挥功能作用。在卵细胞和中央细胞中异位表达VuBBML1基因，加上自花授粉后的中央细胞受精，产生了有活力的种子，随后获得单倍体植株。上述工程方法可能是一种有前景的替代方案，用于编程单倍体以在染色体加倍后的第一代快速获得纯合系。在作物中诱导无性繁殖的频率通常仍然过低，这限制了合成无融合生殖在田间的应用。尽管如此，在水稻的案例中，几乎实现了合成无融合生殖的完全渗透——所产生的杂交植物在多个世代中产生了超过95%的克隆种子。进一步的研究应侧重于确定能够显著提高这种生物工程策略效率的因素，并且研究天然无融合生殖物种可能在这方面有所帮助。合成无融合生殖的最后一步，即形成有活力的胚乳，是另一个影响无融合生殖工程系统效率的因素。基因组剂量和印记（imprinting）在胚乳形成中起关键作用。在大多数有性被子植物中，2:1的母本与父本基因组比例对于该组织的正常发育至关重要，而比例的改变通常导致种子异常。相反，天然无融合生殖者耐受基因组剂量的不平衡，并且无论基因组比例如何都能发育出有活力的种子。然而，这可能会阻碍合成无融合生殖者中有活力种子的发育；因此，绕过胚乳中的印记和/或剂量障碍将有助于无融合生殖技术的工程化。由于精子细胞激活和中央细胞受精依赖于卵细胞专门分泌的EC1蛋白，孤雌生殖的启动可能会因EC1蛋白缺乏而额外阻断中央细胞的受精。跳过中央细胞受精不是诱导克隆种子的先决条件，但自主胚乳也可以在有性物种中被人为诱导。FIS-PRC2（FERTILIZATION-INDEPENDENT SEED-POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX 2）基因和植物激素生长素在受精后的种子发育中起重要的调节作用。FIS-PRC2复合物可能通过沉默TAR1（TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE OF ARABIDOPSIS1）和YUC10（YUCCA10）基因（在生长素生物合成中具有关键功能）来阻止胚乳形成的启动，而它们的父本表达可能促进胚乳发育的启动。在拟南芥中，FIS基因（medea, fie, fis和msi1）的突变导致受精非依赖性胚乳起始，尽管胚乳不进行细胞化且种子最终会中止发育。研究发现，fis突变体中自主种子的发育与通常仅在受精后于胚乳中表达的单性生殖表达基因YUC10的母本等位基因的去抑制同时发生。fis突变体同时表现出生长素报告基因的异位激活，这表明存在受精非依赖性的生长素信号激活。最近研究表明，在水稻中，胚乳发育的遗传和表观遗传调控与拟南芥中描述的类似。鉴定了两个EMBRYONIC FLOWER2（EMF2）基因同源物：OsEMF2a和OsEMF2b，它们编码PRC2复合物的锌指组分。OsEMF2a的突变导致胚乳在无受精情况下发育，涉及中央细胞核的增殖、明显的细胞质结构域以及淀粉粒和蛋白储存液泡样结构的积累。PRC2在水稻胚乳发育调控中的作用也通过对PRC2 FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM（FIE）同源物的分析得到了证实。Osfie1和Osfie2双突变体表现出高频率的无性胚胎发育和自主胚乳形成，而单Osfie2突变体的胚珠以较低频率表现出无性原胚样结构而无需受精。这些结果表明自主胚乳促进了无性胚胎发育。需要指出的是，无融合生殖领域的基础研究仍在继续，涉及非模式物种，并依赖于经典研究方法与现代分子技术的结合。无性生殖改变了细胞的发育程序及其代谢，而这些都受到调控机制的调节。除了直接的细胞间通讯和激素信号外，表观遗传调控（包括特定转录因子的激活、非编码RNA分子（miRNA, siRNA）的信号传导、基因表达的调节和蛋白质构象的变化）对这些机制尤为重要。胚珠体细胞与进入有性或无融合生殖发育途径的细胞之间的通讯主题，特别是在细胞壁修饰的背景下，是当前的研究方向之一。细胞壁化学成分的变化是细胞对胁迫的响应之一，胼胝质是细胞壁的瞬时成分，其沉积由活性氧（ROS）促进。这种多糖在多种生物学过程（包括早期有性和无融合生殖事件）的细胞间信号传导中发挥重要的调节作用。近期数据表明，在有性生殖中，胼胝质围绕大孢子母细胞沉积，可能是对ROS的响应。相反，在启动无孢子生殖或二倍体孢子生殖的细胞壁中，胼胝质沉积不发生或不完全。这些细胞中聚胺生物合成和亚精胺代谢的高活性可以清除ROS，从而改变胼胝质的沉积模式。这可能间接表明胼胝质在调节细胞间信号传导中的作用。在柑橘属中，珠心胚的分化初始细胞通过增厚的细胞壁与周围的珠心细胞隔离，这种修饰通常与胁迫反应有关。对多胚性和单胚性胚珠的比较分析表明，胼胝质合成酶基因UGT和其他细胞壁修饰相关基因（LAC, ACHI和CHI）——被归类为“胁迫响应”类别——在多胚性胚珠中表达上调。报告还表明，阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan proteins, AGPs）参与了早期有性和无融合生殖过程中胚珠内的细胞间信号转导。JIM13抗体检测到的AGPs已被证明是无孢子生殖山柳菊属、兼性无融合生殖草莓*Fragaria x ananassa*和二倍体孢子生殖*Taraxacum belorussicum*中有性和无融合生殖细胞谱系的早期细胞标记。然而，关于AGP作为胚胎学过程潜在信号源的作用的报告仍然具有推测性，其作用机制尚未阐明。尽管迄今付出了巨大的科学努力，但为了了解早期无融合生殖过程中基于胚珠的细胞间信号传导途径原理，还需要进一步的分子研究。

### 挑战与未解决的问题
本综述中概述的发现仅代表了无融合生殖工程（技术）众多进展的一小部分，这些进展结合了基因组学、转录组学和蛋白质组学的方法。基因组数据的日益可用性和分子生物学工具的持续增强，特别是随着基因组编辑技术的密集发展，在其他作物中实际应用合成无融合生殖正变得越来越可行。然而，仍然存在重大限制，因为每个物种都是一个独特的案例——必须考虑分类关系和倍性进化，因此有必要研究各种突变构型。例如，MiMe系统似乎不能作为通用工具以相同方式用于每个研究物种；所有证据表明它必须针对每个具体案例进行调整。试图在陆地棉*Gossypium hirsutum*中实施该突变系统显示出严重限制——所得转基因植株雄性不育，即使在用野生型花粉授粉后也无法产生种子。在大豆*Glycine max*中实施MiMe系统也遇到了限制。报告了男性减数分裂异常（在第一次减数分裂期间染色体丢失）、跳过第二次减数分裂的效率低下。结果得到了非整倍四倍体（aneutetraploids）而非预期的四倍体。

因此，什么因素决定了MiMe基因型成功转移到多种作物中，这个问题仍然没有答案。许多研究表明，负责产生未减数配子的基因的成功实施只是部分成功；问题在于克隆种子形成的表达程度较低，这构成了严重的限制。合成无融合生殖品系在多代中的表现可能受到不可预见后果的限制，例如遗传多样性的丧失和有害突变的随时间累积，因此另一个挑战是制定在育种群体内维持遗传多样性的策略。必须强调的是，实现合成无融合生殖的系统类似于假配合（pseudogamy），这意味着种子生产仍然依赖于雄配子的贡献，而雄配子对于胚乳形成是必需的。一个完全自主的系统，允许在中央细胞不受精的情况下生产克隆种子，尚未开发出来。在作物无融合生殖植株中花粉的缺失将非常有益，因为它确保无减数分裂的卵细胞不会被受精，并且也消除了导入有性作物的风险。在这方面，具有自主种子形成的天然无融合生殖者可以作为新数据的良好来源。在研究有性和无融合生殖过程的分子基础时，雌性生殖细胞在胚珠孢子体组织内的位置似乎很重要。彻底理解调节体细胞和配子体细胞之间信号交流的复杂遗传和激素网络，可能有助于解开自主种子形成之谜。还有一个问题是，为什么只有少数无融合生殖物种（主要来自菊科）能够自发产生种子而无需受精？为澄清这个问题，需要深入的分类学、系统发育/系统基因组学分析。当前关于无融合生殖谱系进化的研究高度重视整合形态学、细胞胚胎学、生态学和遗传学领域的数据，因为结合这些方法可以帮助解决无融合生殖者短期和长期进化之谜。此外，生物信息学技术的进步为整合理解植物物种形成和随后宏观进化所必需的大量基因组数据提供了新工具。基于人工智能的工具在处理分类学上复杂的植物类群时可能特别有帮助。一个应考虑的重要问题是管理基因工程无融合生殖作物使用的法律框架。假设一个非常乐观的情景，即我们拥有无融合作物品种（如玉米、水稻、小麦、大豆）在群体中完全渗透的无融合生殖性状和高育性，那么在农业中实施无融合生殖技术必须遵守当地的法律法规。许多国家可能对此技术的使用有重大限制。公众认知也可能发挥作用，就像转基因生物一直引起公众争议一样。在这方面，获取可靠信息和有效教育无疑将是解决方案。