《Journal of the Formosan Medical Association》：Concurrent evolution of infant oral and gut microbiota implies oral-to-gut transmission
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研究人员通过前瞻性纵向队列研究，探讨婴儿口腔与肠道微生物群在早期生命中的关系。研究纳入2019年至2023年间于单一医疗中心出生的15名健康婴儿，在出生后第1-5天每日收集粪便样本，并在1、2、4、6月龄时采集唾液、颊黏膜及粪便样本，进行16S rRNA基因测
研究人员通过前瞻性纵向队列研究，探讨婴儿口腔与肠道微生物群在早期生命中的关系。研究纳入2019年至2023年间于单一医疗中心出生的15名健康婴儿，在出生后第1-5天每日收集粪便样本，并在1、2、4、6月龄时采集唾液、颊黏膜及粪便样本，进行16S rRNA基因测序。结果显示，婴儿肠道生态位分化在出生后第2天即已开始；双歧杆菌属(Bifidobacterium)在出生5天内罕见，自1月龄起逐渐增多。唾液与颊黏膜微生物组成相似。尽管多数肠道与口腔微生物独立演化，口腔中的罗斯氏菌属(Rothia)、普雷沃氏菌属(Prevotella)及韦荣氏球菌属(Veillonella)与其肠道对应菌属的发育存在相关性；另有益生菌属(Coprococcus)、普雷沃氏菌属、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、粪杆菌属(Faecalibacterium)及巨球型菌属(Megasphaera)在唾液与肠道间亦显示关联。结论认为，筛查和治疗婴儿肠道微生态失衡(dysbiosis)的最佳时机应在出生后早期；结合既往研究，瘤胃球菌属(Ruminococcus)与韦荣氏球菌属(Ruminococcus and Veillonella)值得进一步研究以确认其口腔-肠道传播及治疗早期肠道微生态失衡的潜在价值。
该研究发表于《台湾医学会杂志》(Journal of the Formosan Medical Association)，旨在阐明经体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)受孕的新生儿在不同产后阶段的肠道与口腔微生物组的独特组装及渐进性成熟过程。研究背景方面，虽然既往已有多项纵向队列研究分别追踪了不同民族正常婴儿的口腔和肠道微生物组的转变，但均缺乏出生后最初几天内微生物数据的连续变化记录。现有文献中唯一描述该时期人类微生物群演替的研究为1996年日本学者采用培养依赖法分析粪便菌群的工作，然而传统培养方法存在技术局限性——约20%至60%的微生物类型因不可培养而无法被充分揭示。从解剖学角度，口腔作为胃肠道(GI tract)的门户，新生儿口腔微生物群理论上可通过传播影响肠道微生物群的初始发育，但两者关系研究稀少。近期意大利横断面研究发现口腔链球菌属(Streptococcus)和韦荣氏球菌属是肠道微生物群形成的"种子"物种，但多数婴儿唾液与肠道微生物群呈独立演化。因此，该研究旨在建立婴儿早期生命中口腔与肠道微生物生态系统的时间演替规律，特别关注出生后最初几天，并探讨口腔微生物群对肠道微生物群落形成的贡献。
该研究由台湾地区科技部门资助，采用前瞻性纵向队列设计，样本来源于2019年1月至2023年2月间在国家台湾大学医院(NTUH)出生的IVF/ICSI受孕新生儿，排除重大出生缺陷或已知遗传异常者。样本采集方面，粪便样本于出生后第1-5天每日收集，并于1、2、4、6月龄时采集；唾液样本通过无菌木签棒浸泡舌下区获得，颊黏膜样本以塑料无菌棉签分别擦拭左右颊黏膜；口腔样本在出生后第1周内采集1次，后续于相同月龄点采集。所有样本由受训医务人员或其父母采集，4°C运输后于-80°C保存。主要技术方法包括：使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit及QIAamp DNA Blood Mini Kit提取细菌DNA；采用通用引物341F/805R扩增16S rRNA基因V3-V4高变区；通过Nextera XT DNA Library Preparation Kit构建配对末端(2×300)文库，在Illumina MiSeq 2000测序仪上行高通量测序；使用USEARCH (v8.001623)合并配对末端读段，Mothur (v1.35.1)进行质量过滤，UPARSE流程生成操作分类单元(OTUs，97%相似度)，以Greengenes 13_5数据库进行物种注释；采用R软件及phyloseq包进行多样性分析及统计处理。
研究结果部分，研究人群概述显示共15名新生儿参与，其中3名为32~36
+6周的中晚期早产儿，出生于14名健康母亲（含1对双胞胎）。肠道微生物群特征分析表明，出生后第1天新生儿肠道主要由拟杆菌门(Bacteroidetes，38.15±2.95%)和厚壁菌门(Firmicutes，37.71±3.44%)定植，但变形菌门(Proteobacteria)从第2天的16.76%显著增至41%并在后续时间点持续占优势，直至1月龄时放线菌门(Actinobacteria)相对丰度才显著上升。属水平上，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)在除第1天外的研究期间近乎主导粪便微生物群；双歧杆菌属在出生5天内不明显，自1月龄后逐渐出现并增多；普雷沃氏菌属和瘤胃菌科在出生后第1天即呈陡峭下降趋势。
唾液微生物群特征分析表明，研究全程厚壁菌门比例较高但随时间变化。拟杆菌门和变形菌门在1月龄分别从24.92%降至4.16%、从19.03%降至2.95%，但自4月龄起两者均显著攀升；放线菌门丰度在研究期间无明显变化。属水平上，链球菌属在所有时期占唾液微生物群多数；乳杆菌属(Lactobacillus)和Gemellaceae科在1月龄达最高丰度(7.20±3.37%)；韦荣氏球菌属和奈瑟菌属(Neisseria)出生时不多见，自4月龄起逐渐增多。
颊黏膜微生物群特征分析显示，变形菌门在出生后第1周丰富(77.01±2.82%)，之后急剧下降，厚壁菌门随后接管并成为后续时间点的主导菌门。拟杆菌门自2月龄起缓慢增加，放线菌门在所有时间点保持相对恒定。属水平上，无色杆菌属(Achromobacter)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)和产碱杆菌科(Alcaligenaceae)在出生后第1周后分别从10.46%、45.25%和6.43%骤降至0.02%、1.34%和0.05%；链球菌属自1月起构成颊黏膜微生物群多数；韦荣氏球菌属自1月龄出现并在6月龄略升至6.35±1.48%。
微生物差异与婴儿年龄及采样位点的关系方面，粪便微生物群的α多样性(alpha diversity)在分娩当日极高，出生后5天内急剧下降，随后随婴儿年龄增长逐渐回升；唾液生态系统在出生后第1周α多样性指数最高，随后骤降，至4月龄引入固体食物起 steady growth；颊黏膜生态系统多样性在断奶前无渐进性增加，但6月龄时Shannon指数显著增加(p=0.014)，为延迟表现。唾液微生物群的α多样性和均一性均高于颊黏膜和粪便。
肠道与口腔微生物群共享的属水平OTUs分析中，4名具有完整样本的婴儿接受深入评估，20个菌属在口腔（唾液或颊黏膜）和粪便样本中所有时间点均被检测到。除出生后第1周可能代表母体环境微生物污染外，罗斯氏菌属、普雷沃氏菌属和韦荣氏球菌属在粪便中初始水平低，但自1月龄起在唾液、颊黏膜和粪便中持续增加；另有益生菌属、普雷沃氏菌属、瘤胃菌科、粪杆菌属和巨球型菌属仅在唾液和肠道随时间增加，颊黏膜中无此趋势；其余12个共享菌属在口腔和肠道生态系统中独立演化。
讨论部分，研究人员指出该研究清晰展示了新生儿出生后肠道微生物群的连续每日演替，这一采用16S rRNA基因测序技术的前瞻性纵向研究具有重要价值。通过早期阶段密集的粪便采样观察发现，生态位适应性肠道微生物群的选择在出生后第2天即已发生，提示筛查和干预婴儿肠道微生态失衡的时机应非常早。研究的另一创新点在于通过同一婴儿的粪便与口腔样本的同时连续采集，识别出某些口腔微生物群与其肠道对应菌属存在时间相关性。
肠道生态系统动力学分析显示，兼性厌氧菌如肠杆菌科、葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属是出生后第1周的初始居民；环境氧气消耗后，专性厌氧菌如双歧杆菌属、拟杆菌属(Bacteroides)和瘤胃菌科定植建立。然而，该研究中双歧杆菌属的出现和优势化（1月龄后）较既往文献（出生后4-7天）慢得多，此差异可能源于研究方法不同——培养法的检测下限通常为1×10
3/g，而高通量DNA测序方法可能遗漏极低丰度的分类群。
除出生后第1周外，粪便和唾液的细菌多样性随婴儿成长而增加，最高微生物复杂度在引入固体食物后（最早4月龄）出现。颊黏膜细菌变异保持静止直至约6月龄牙齿萌出时。第一颗牙齿的出现不仅破坏黏膜完整性，还提供了非脱落性牙面、龈沟及牙间隙等新生态位供不同微生物定植生长；婴儿手入口腔频率增加也可能带入新物种；出牙后唾液的组成改变和产量增加亦可重塑口腔生态系统。但需注意后期时间点和颊黏膜样本的较高脱落率。
唾液与颊黏膜核心口腔微生物群相似，主要由链球菌属和罗斯氏菌属组成。颊黏膜中变形菌门异常且 exclusively 高的现象可能源于：母亲产前接受预防性或治疗性抗生素（头孢菌素或青霉素）暴露，导致变形菌门（尤其医院分离的慢生根瘤菌科等）增加而链球菌科减少；颊黏膜佩利肯(pellicle)富集浓缩黏蛋白和分泌性免疫球蛋白A(sIgA)，促进并阻止特定细菌定植，使其成为区别于唾液的独特微生物栖息地。
该研究定义潜在口腔"种子细菌"的标准为：除出生后第1周数量外，细菌在粪便中最初水平低但在唾液和颊黏膜中相对较高，且随时间推移粪便中数量随口腔增加而增加。依此标准，链球菌属未被认定，而罗斯氏菌属、普雷沃氏菌属和韦荣氏球菌属被识别为潜在"种子细菌"，这与Reddel等的研究发现大不相同——差异主要在于该研究的纵向设计、纳入剖宫产及配方奶喂养婴儿、以及更多的口腔采样位点。值得注意的是，5种细菌（益生菌属、普雷沃氏菌属、瘤胃菌科、粪杆菌属和巨球型菌属）仅在唾液与肠道生态系统间显示关联趋势，颊黏膜与粪便间无此相互作用；研究人员未将其视为潜在口腔"种子细菌"，因为唾液本身可能不反映真实口腔栖居者。
健康相关肠道细菌如拟杆菌属菌株在剖宫产婴儿出生后早期即受扰动。Bogaert等的重要网络分析揭示，拟杆菌属的消失可能是因剖宫产婴儿缺乏支持性物种（包括双歧杆菌属、柯林斯菌属(Collinsella)、瘤胃球菌属和韦荣氏球菌属）所致。若口腔-肠道种子过程真实存在，根据该研究结果，含瘤胃球菌属和韦荣氏球菌属的新生儿口服益生菌可能成功恢复其在肠道生态系统中的丰度，并通过维持拟杆菌属菌株进一步纠正肠道微生态失衡，尤其对剖宫产婴儿具有重要意义。
研究局限性包括样本量小、部分样本数据不完整、两例产后抗生素暴露可能混淆微生物群模式、无法调整分娩方式、早产、喂养类型及母体或婴儿抗生素暴露等关键混杂因素、以及限定于单一中心的IVF/ICSI婴儿限制其普适性。此外，共享OTUs应被视为关联而非严格意义上的传播证据；16S rRNA测序分辨率通常限于属或种水平，而菌株水平的鉴定才是细菌传播调查所需。因此，该探索未能提供细菌从一生态系统迁移至另一生态系统的直接证据，未来需要大规模、溯源追踪的纵向研究，采用培养依赖法或鸟枪法测序进行确认。
研究结论部分指出，该研究拓展了对IVF/ICSI术后分娩新生儿肠道与口腔微生物组在不同产后阶段的独特组装及渐进性成熟的知识。肠道微生物群的生态位分化在出生后很早即已开始，提示早期新生儿筛查和干预可能至关重要。婴儿肠道微生物群的动态主要由局部适应而非口腔细菌移民驱动，但某些细菌口腔与肠道微生物趋势间的关联探索了从口腔到肠道种子的概念，可能为治疗早期肠道微生态失衡提供新的治疗策略。
