两个糖生物碱代谢基因在番茄α-番茄碱生物合成和基础防御中的作用

《Molecular Plant Pathology》：The Role of Two Glycoalkaloid Metabolism Genes in α-Tomatine Biosynthesis and Basal Defence in Tomato

　　

甾体糖生物碱（Steroidal Glycoalkaloids, SGAs）和皂苷（saponins）是以胆固醇为基础的甾体代谢物，具有抗微生物活性及潜在的药理学价值。黑龙葵（*Solanum nigrum*）中的皂苷uttroside B在防御植食性昆虫方面发挥重要作用，并表现出抗肝细胞癌活性。番茄（*Solanum lycopersicum*）糖生物碱α-番茄碱（α-tomatine）因其抗营养效应而被广泛研究，但其在保护植物抵御真菌病原体方面的作用尚缺乏充分探讨。α-番茄碱的生物合成途径涉及多个成簇排列的糖生物碱代谢（Glycoalkaloid Metabolism, GAME）基因。本研究中，研究人员利用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术构建了SlGAME4和SlGAME2的单基因敲除突变体。SlGAME4突变体不能积累糖生物碱，而是将代谢流重新导向甾体皂苷（uttroside B）的合成。SlGAME2突变体中α-番茄碱含量未发生变化，表明此前报道的催化木糖转移至β1-番茄碱的SlGAME2基因并不参与α-番茄碱的生物合成。利用四种真菌性番茄病原体进行感染试验，结果显示SlGAME4突变体植物对灰葡萄孢（*Botrytis cinerea*）的敏感性略有增加，但对其他三种真菌的敏感性与野生型相当。在SlGAME4突变体番茄和黑龙葵上感染灰葡萄孢时，观察到α-番茄碱响应基因的上调表达，表明uttroside B能够诱导类似于α-番茄碱的真菌转录响应。此外，研究人员发现由糖基水解酶（glycosyl hydrolases）和糖基转移酶（glycosyltransferase）介导的对植物皂苷的耐受机制有助于灰葡萄孢在SlGAME4突变体植物和黑龙葵上的毒力发挥，表明uttroside B同样参与对真菌病原体的防御，并可被灰葡萄孢解毒。

本研究旨在探究番茄α-番茄碱这一甾体糖生物碱在植物基础防御中的作用机制，聚焦于糖生物碱代谢（GAME）基因途径中两个关键基因SlGAME4和SlGAME2的功能验证。甾体糖生物碱作为茄科和百合科植物的组成型抗微生物代谢物，对病原菌和草食性昆虫具有广谱毒性。α-番茄碱是番茄中主要的甾体糖生物碱，在营养组织和青果中大量积累，其生物合成从胆固醇前体开始，由一系列GAME基因编码的酶催化完成。已有研究表明，GAME4基因编码的细胞色素P450蛋白催化甾体糖生物碱生物合成的首个关键步骤，而GAME2基因曾被注释为催化α-番茄碱合成最后一步的木糖基转移酶。然而，关于α-番茄碱在真菌病害防御中的实际贡献，以及GAME2基因的确切功能，仍存在不明确之处。此外，病原真菌已演化出多种α-番茄碱耐受机制，包括分泌糖基水解酶（即"番茄碱酶"，tomatinase）进行水解解毒，以及涉及膜修复和修饰的非降解性耐受机制。因此，有必要通过基因编辑技术构建功能缺失突变体，精确解析特定基因在代谢途径和植物防御中的真实作用，并评估代谢中间产物或替代产物对病原真菌的影响。

研究人员以感病性番茄品种"MoneyMaker"为背景，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，针对SlGAME4和SlGAME2基因分别设计四组单导向RNA（sgRNA），构建了独立的单基因敲除突变体系。通过筛选获得T0代双等位基因突变植株，并进一步在T1代鉴定纯合突变体用于后续研究。代谢物分析采用液相色谱-三重四极杆质谱联用技术（LC-QqQ-MS）和超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UHPLC-HRMS），对突变体及野生型植株的不同组织（幼叶、成熟叶、茎、根）和果实（青果、红熟果）中的α-番茄碱、番茄啶（tomatidine）及uttroside B等皂苷类代谢物进行定性和定量分析。基因表达分析采用逆转录定量PCR技术（RT-qPCR），检测番茄组织中GAME基因的表达谱，以及灰葡萄孢感染过程中α-番茄碱响应基因的转录变化。病原感染试验选用灰葡萄孢、茄链格孢（*Alternaria solani*）、大丽轮枝菌（*Verticillium dahliae*）和番茄叶霉病菌（*Fulvia fulva*）四种真菌性病原体，对SlGAME4敲除突变体进行致病性评估；同时利用已知的番茄碱酶基因突变或过表达菌株，在SlGAME4突变体和黑龙葵上进行毒力互补或增强试验，以验证真菌耐受机制的作用。

SlGAME4和SlGAME2的CRISPR/Cas9介导突变及突变体表型鉴定——四组sgRNA成功诱导SlGAME4和SlGAME2基因产生1至1358 bp不等的缺失突变，T1代获得纯合突变体用于功能分析。SlGAME4敲除突变体的甾体糖生物碱谱发生根本性改变，完全丧失α-番茄碱和番茄啶的积累能力；而SlGAME2敲除突变体中α-番茄碱含量与野生型相当，且未检测到β1-番茄碱的积累，表明SlGAME2并非α-番茄碱生物合成所必需。SlGAME4突变体重定向积累甾体皂苷uttroside B——液相色谱-质谱分析显示，SlGAME4敲除突变体的叶片和果实中不含有可检测的α-番茄碱和番茄啶，转而积累uttroside B及其戊糖加合物，而野生型"MoneyMaker"则含有α-番茄碱和番茄碱苷（esculeoside A）。

SlGAME4敲除突变体对灰葡萄孢的敏感性增加——接种试验表明，SlGAME4敲除突变体对灰葡萄孢的敏感性略有升高，表现为病斑扩展程度增加；但对茄链格孢、大丽轮枝菌和番茄叶霉病菌的敏感性与野生型无显著差异。α-番茄碱响应基因在uttroside B积累的突变体和黑龙葵中同样上调——RT-qPCR检测显示，在不含α-番茄碱的SlGAME4敲除突变体和黑龙葵叶片上感染灰葡萄孢时，多种α-番茄碱响应基因（包括BcTom1和BcGT28a等）均在接种后24小时显著上调表达，说明uttroside B能够诱导与α-番茄碱相似的真菌转录响应。

真菌α-番茄碱耐受机制有助于在SlGAME4突变体上的毒力发挥——利用番茄碱酶基因缺失或过表达的灰葡萄孢菌株进行感染试验，结果显示BcTom1缺失突变体在SlGAME4敲除突变体上的致病力显著降低；而过表达三种不同类型番茄碱酶基因（BcTom1、CfTom1、SlTom1）或糖基转移酶基因BcGT28a均能增强原本致病毒性较低的M3a菌株在SlGAME4突变体上的感染能力。BcTom1促进灰葡萄孢在黑龙葵上的致病性——在黑龙葵上，α-番茄碱响应基因在接种后12小时强烈上调，而马铃薯（含有不同寡糖链结构的甾体糖生物碱）上则无此现象；番茄碱酶缺失的灰葡萄孢菌株在黑龙葵上形成的病斑显著减小，证实了对uttroside B的耐受机制对于真菌在黑龙葵上的成功定殖至关重要。

研究人员在讨论部分系统总结了本研究的主要发现和学术意义。首先，关于SlGAME2基因功能的重新注释，研究结果明确挑战了此前Itkin等人（2013）提出的SlGAME2编码木糖基转移酶、催化α-番茄碱最终合成步骤的假设。鉴于所有四株独立的SlGAME2敲除突变体均产生正常水平的α-番茄碱，且不积累β1-番茄碱，研究人员认为SlGAME2并不参与α-番茄碱的生物合成。这一结论得到了多方面证据的支持：SlGAME2与马铃薯中催化鼠李糖转移的SGT3酶具有同源性而非木糖转移酶；SlGAME2转录本在成年展开的叶片中难以检测，而催化番茄啶前三个糖基化步骤的SlGAME1/17/18基因则在各组织中高表达；近期研究鉴定出的*Solanum commersonii*来源的ScGTR2酶及其番茄直系同源基因Solyc12g009930才是真正的木糖转移酶。因此，SlGAME2的功能注释需要修正，其真实底物可能是UDP-鼠李糖而非UDP-木糖。

其次，关于uttroside B的防御功能及其与真菌耐受机制的相互作用，是讨论的另一个重点。SlGAME4敲除导致代谢流从α-番茄碱转向uttroside B，这种替代性皂苷仍在一定程度上维持了植物的基础防御能力——突变体仅对灰葡萄孢的敏感性轻微增加，而对其他三种病原真菌的抗性与野生型相当。更为重要的是，uttroside B能够像α-番茄碱一样诱导灰葡萄孢中α-番茄碱响应基因的表达上调，这表明两者具有结构相似性的四糖或五糖寡糖链是诱导真菌转录响应的关键结构特征。这一发现也得到了黑龙葵-灰葡萄孢互作系统的支持：黑龙葵作为天然积累uttroside B而非α-番茄碱的物种，同样表现出α-番茄碱响应基因的诱导表达，且番茄碱酶BcTom1对该菌株在黑龙葵上的致病性不可或缺。

最后，研究人员探讨了研究的农业应用前景和未来方向。番茄果实成熟过程中α-番茄碱向番茄碱苷的转化导致果实对病原菌的易感性增加，而SlGAME4敲除突变体果实中积累的uttroside B可能在采后贮藏期间提供替代性保护。此外，根系分泌α-番茄碱已被报道影响番茄根际微生物组组成，因此SlGAME4突变体改变皂苷组成后对其根际微生物生态及植物整体适应度的影响值得进一步探究。综上，本研究通过精准的基因编辑技术更新了番茄糖生物碱代谢途径的认知，揭示了植物代谢可塑性与病原真菌协同进化的新层面，为理解植物化学防御的分子机制和开发抗性育种新策略提供了重要参考。