《Talanta》：Template-Independent Poly-adenine Elongation Enables Multivalent CRISPR/Cas12a Activation for Amplified Lateral Flow Biosensing
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陈宝强|杨海东|赵佳|王毅|李红霞|王晨灿|郭龙华|徐建国中国嘉兴市嘉兴大学生物与化学工程学院，多模态感知与智能系统省级重点实验室，分子识别与传感嘉兴重点实验室，314001摘要末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）是一种不依赖模板的DNA聚合酶，在免疫系统发育中起着关键作用，并作为急性
陈宝强|杨海东|赵佳|王毅|李红霞|王晨灿|郭龙华|徐建国
中国嘉兴市嘉兴大学生物与化学工程学院，多模态感知与智能系统省级重点实验室，分子识别与传感嘉兴重点实验室，314001
摘要
末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）是一种不依赖模板的DNA聚合酶，在免疫系统发育中起着关键作用，并作为急性淋巴细胞白血病的重要生物标志物。然而，目前的TdT活性分析方法通常依赖于复杂的仪器设备，缺乏简单且便携的检测方式。本文报道了一种基于TdT的多价CRISPR/Cas12a侧向流动检测方法，可实现无需仪器的TdT活性敏感检测。在该方法中，TdT催化的多聚腺苷（poly-A）延伸将酶活性转化为富含腺苷的DNA支架，这些支架能够招募多个crRNA分子，从而触发Cas12a的多价激活。这一设计有效结合了TdT活性与CRISPR/Cas12a的信号放大功能。激活的Cas12a随后会诱导报告基因探针的切割，切割事件会在侧向流动条上转化为可见信号。该检测方法的检测限为0.016 U/mL，视觉检测限为0.05 U/mL。此外，该方法对TdT的特异性较高，对其他聚合酶的干扰较小，在人血清样本中的回收率在98.8%至103.7%之间。这项工作扩展了CRISPR/Cas12a系统在酶活性检测中的应用范围，为TdT的即时检测提供了一个简单实用的平台。
引言
末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）是一种独特的DNA聚合酶，能够在没有模板的情况下向DNA链的3′末端添加核苷酸[1]，[2]。这种独特的酶活性在免疫系统发育过程中的V(D)J重组中起着关键作用，并被广泛认为是急性淋巴细胞白血病（ALL）的重要生物标志物[3]，[4]。TdT的异常表达或失调与淋巴细胞的恶性转化密切相关，使其成为疾病诊断和预后评估的宝贵指标[5]，[6]。此外，TdT活性常用于临床和研究环境中评估淋巴细胞发育和免疫功能。因此，敏感可靠的TdT活性检测对于临床诊断和生物医学研究具有重要意义。迄今为止，已经开发了多种TdT活性分析方法，从早期的凝胶电泳检测到最近的荧光和多模式生物传感平台[7]，[8]，[9]。这些研究显著提高了TdT检测的灵敏度，在某些情况下甚至可以在生物样本或白细胞提取物中进行分析。然而，许多方法仍然依赖于纳米材料辅助的信号放大或专用仪器，这增加了操作复杂性，限制了它们在即时检测中的适用性[7]，[9]，[10]，[11]。开发一种简单、灵敏且无需仪器的直接视觉检测TdT活性的方法仍然非常必要。
近年来，侧向流动检测（LFAs）因其简单性、快速响应、低成本和无需仪器的读数结果而受到广泛关注，非常适合用于即时检测[12]，[13]，[14]。然而，它们相对较低的灵敏度和定量能力限制了其更广泛的应用，因此需要引入有效的信号放大策略。为了解决这一限制，基于CRISPR/Cas12a的生物传感技术作为一种强大的放大平台应运而生，因为它具有可编程的目标识别能力和对单链DNA的独特旁路切割活性，从而实现高效的信号放大[15]，[16]，[17]，[18]，[19]。这一特性已在核酸检测中得到广泛应用。然而，传统的CRISPR/Cas12a系统通常由预定义的核酸序列激活[20]，[21]，[22]，[23]，[24]，[25]，这使其本质上依赖于序列特异性识别。这种要求限制了它们直接用于检测如TdT这样的非序列依赖性酶活性的能力，从而对扩展CRISPR/Cas系统到基于活性的检测构成了根本挑战。同时，尽管在TdT相关的信号转导系统中探索了侧向流动和其他检测格式，但这些研究主要将TdT作为辅助信号放大组件来检测其他目标，而不是实现直接的TdT活性读数[26]，[27]，[28]，[29]，[30]。专门为直接检测TdT活性设计的条带检测方法仍然很少，尤其是那些能够同时实现高灵敏度和可靠定量分析的方法。因此，将CRISPR/Cas12a的放大能力与侧向流动的简单性和视觉读数相结合，为开发灵敏、快速且无需仪器的TdT检测平台提供了有前景的策略。
综上所述，我们开发了一种基于TdT的多价CRISPR/Cas12a侧向流动检测方法，用于敏感且无需仪器的TdT活性检测。在该方法中，利用TdT催化的不依赖模板的多聚腺苷（poly-A）延伸将酶活性转化为富含腺苷的DNA支架，这些支架随后招募多个crRNA分子并触发Cas12a的多价激活。这一设计有效结合了非序列依赖性的酶活性与序列依赖性的CRISPR/Cas12a识别。激活的Cas12a进一步诱导双标记报告基因探针的高效切割。在侧向流动系统中，完整的报告基因参与测试线（T线）上的夹心复合物的形成，而报告基因的切割会破坏这种相互作用，导致T线信号消失。通过这种方式，TdT活性被转化为侧向流动条上的可见读数。与传统方法相比，所提出的方法通过poly-A介导的多价激活机制实现了信号放大，从而实现了从TdT活性到CRISPR/Cas12a激活的高效信号转导。此外，与侧向流动平台的结合使得读数简单、快速且无需仪器。这些特点共同提高了检测的灵敏度、操作简便性和实际应用性，凸显了该方法在TdT相关疾病的生物医学研究和临床诊断中的潜力。
章节摘录
试剂和材料
所有寡核苷酸（表S1）由Sangon Biotech Co., Ltd.（上海，中国）合成。TdT及其10×反应缓冲液（500 mM钾乙酰钴酸盐、200 mM Tris-乙酸盐、100 mM镁乙酸盐，pH 7.9）、CoCl2（2.5 mM）、Large（Klenow）片段、phi29 DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶购自New England Biolabs（北京，中国）。碳酸钾（K2CO3，99%）和牛血清白蛋白（BSA，98%）购自Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.（上海）。
基于TdT的多价CRISPR/Cas12a侧向流动检测的原理
所提出的TdT检测策略的工作原理如图1所示，包括三个连续过程：TdT介导的引物延伸、CRISPR/Cas12a的多价激活和基于侧向流动的视觉信号转导。首先，TdT在dATP存在下催化DNA引物（5′-TCAGCGCTGAGGTAATGCTG-3′）的3′末端的延伸，生成长的poly-A尾。在此过程中，TdT活性被编码到长度中
结论
总之，我们开发了一种基于TdT的多价CRISPR/Cas12a侧向流动检测方法，用于敏感且无需仪器的TdT活性检测。该方法通过poly-A支架介导的多价激活机制实现高效信号放大，从而实现快速信号生成和改善的分析性能。该检测方法具有较低的检测限、对非目标聚合酶的高特异性，并在人血清样本中表现出可靠的适用性。
CRediT作者贡献声明
王毅：研究、数据分析。赵佳：可视化、数据分析。王晨灿：资源提供、数据管理。李红霞：监督、研究、数据分析。徐建国：撰写-审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。郭龙华：监督、资金获取。杨海东：验证、研究、数据分析。陈宝强：撰写-初稿、方法学设计、研究、数据管理
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了嘉兴市科技计划-社会发展专项项目（项目编号：2025BS009）、浙江省自然科学基金（项目编号：LZ25C200005）、安徽省博士后研究资助计划（项目编号：2025B1069）以及嘉兴大学的研究生科学研究与实践创新项目（项目编号：PSRPIP2025001B）的财政支持。
