《Cancer》：First-line envafolimab plus recombinant human-endostatin in advanced non–small cell lung cancer with PD-L1 tumor proportion score ≥1% (Endouble): A multicenter, prospective, single-arm, phase 2 trial
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背景：该试验旨在评估恩沃利单抗（Envafolimab）与重组人血管内皮抑制素（Recombinant human-endostatin, Rh-endostatin）联合用药在晚期非小细胞肺癌（Non–small cell lung cancer, NSCL
背景：该试验旨在评估恩沃利单抗（Envafolimab）与重组人血管内皮抑制素（Recombinant human-endostatin, Rh-endostatin）联合用药在晚期非小细胞肺癌（Non–small cell lung cancer, NSCLC）患者中的疗效与安全性。
方法：本研究纳入了PD-L1（Programmed death-ligand 1）阳性且无驱动基因突变的初治晚期NSCLC患者。所有患者每21天接受一次恩沃利单抗与Rh-endostatin联合治疗，直至疾病进展或出现不可耐受的毒性。主要终点为客观缓解率（Objective response rate, ORR）和安全性。次要终点包括无进展生存期（Progression-free survival, PFS）、总生存期（Overall survival, OS）、疾病控制率（Disease control rate, DCR）和缓解持续时间（Duration of response, DOR）。研究人员进行了一项探索性分析，以确定与治疗疗效相关的生物标志物。
结果：共计33例患者被纳入疗效和安全性分析。ORR为48.5%（95% CI, 30.8%–66.5%），DCR为81.8%（95% CI, 64.5%–93.0%）。中位PFS为12.3个月（95% CI, 3.1个月–21.5个月）。中位随访时间为13.9个月时，中位OS尚未达到，1年OS率为73.9%。25例（75.8%）患者出现了治疗相关不良事件（Treatment-related adverse events, TRAEs）。6例患者出现了≥3级TRAEs，未报告4级或5级不良事件（Adverse events, AEs）。基于血浆蛋白质组学分析，受试者工作特征曲线（Receiver operator characteristic, ROC）分析显示，基质金属蛋白酶1（Matrix metalloproteinase-1, MMP1）的曲线下面积（Area under the curve, AUC）为0.77（95% CI, 0.61–0.93），肿瘤坏死因子受体超家族成员6B（Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B, TNFRSF6B）的AUC为0.68（95% CI, 0.49–0.87）。联合模型的AUC为0.81（95% CI, 0.66–0.96）。
结论：恩沃利单抗联合Rh-endostatin在PD-L1阳性、驱动基因阴性的晚期NSCLC患者中显示出良好的疗效和可耐受的毒性。
肺癌在全球范围内的发病率和死亡率均位居所有癌症之首。非小细胞肺癌（Non–small cell lung cancer, NSCLC）是最常见的肺癌类型。大量患者在确诊时疾病已进展至晚期，预后较差，5年生存率低于20%。过去十年间，得益于新型抗肿瘤药物的持续研发，NSCLC的治疗取得了显著进展。以免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors, ICIs）为代表的免疫治疗延长了患者的无进展生存期（Progression-free survival, PFS）和总生存期（Overall survival, OS）。ICIs，尤其是靶向程序性死亡蛋白1（Programmed death protein 1, PD-1）和程序性死亡配体1（Programmed death-ligand 1, PD-L1）的药物，已成为无驱动突变的晚期NSCLC患者治疗的重要组成部分。目前，包含ICIs与化疗药物的联合疗法也被批准用于晚期NSCLC的治疗。基于IMpower150研究的结果，阿替利珠单抗（Atezolizumab）、贝伐珠单抗（Bevacizumab）联合化疗已被批准作为晚期非鳞状NSCLC的一线治疗选择。尽管这种以化疗为基础的方法改善了治疗效果，但也带来了较高的治疗相关不良事件（Treatment-related adverse events, TRAEs）发生率，如骨髓抑制。然而，部分患者，尤其是老年患者，可能无法耐受化疗的毒性，这促使研究人员探索适用于NSCLC患者的无化疗治疗模式。
既往研究已广泛报道了无化疗治疗方案在晚期NSCLC中的应用。其中，Seto等人的研究报告了贝伐珠单抗联合阿替利珠单抗作为一线治疗在驱动基因阴性、PD-L1高表达晚期非鳞状NSCLC患者中的疗效。在39名入组患者中，客观缓解率（Objective response rate, ORR）为64.1%，中位PFS（mPFS）为15.9个月。另一项评估信迪利单抗（Sintilimab）联合安罗替尼（Anlotinib）治疗晚期NSCLC疗效的研究共入组了22名受试者，结果显示疾病控制率（Disease control rate, DCR）高达100%，ORR为72.7%，mPFS为15个月。然而，在安全性方面，与安罗替尼相关的不良事件（Adverse events, AEs）发生率较高，包括出血（59.1%）、手足皮肤反应（36.4%）和高血压（31.8%）。事实上，一项关于安罗替尼治疗晚期NSCLC的III期临床研究数据也报告称，与安罗替尼相关的最常见AEs包括高血压（67.7%）、手足综合征（43.9%）、出血（44%）和蛋白尿（28.8%）。因此，安罗替尼相关的毒性在8.8%至22%的患者中需要进行剂量调整。总之，贝伐珠单抗不适用于鳞状NSCLC患者，且部分患者无法耐受安罗替尼的副作用。因此，亟需探索具有更好耐受性和疗效的新型无化疗治疗选择。
重组人血管内皮抑制素（Recombinant human endostatin, Rh-endostatin）是一种在中国研发的抗血管生成药物，既往研究已证实其在鳞状和非鳞状NSCLC中均具有良好的疗效和安全性。Rh-endostatin表现出低毒性，使患者能够耐受治疗，大多数AEs为轻度至中度。恩沃利单抗（Envafolimab）是首个可通过皮下注射给药的PD-L1抑制剂，已在中国获批用于治疗晚期实体瘤。恩沃利单抗的皮下给药方式为患者提供了更便捷和灵活的治疗选择。先前的研究也表明，接受恩沃利单抗治疗的患者免疫相关不良事件（Immune-related AEs, irAEs）的发生率约为10%，且未报告免疫性肺炎或肠炎病例。因此，研究人员开展了这项II期临床试验，前瞻性评估Rh-endostatin联合恩沃利单抗作为晚期NSCLC一线治疗的疗效和安全性。本研究是一项多中心（两个中心）、前瞻性、开放标签的II期临床试验，在连云港市第一人民医院和连云港市第二人民医院进行（注册号：NCT05203276）。入组患者的主要特征包括：年龄18-80岁；东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG）体能状态（Performance status, PS）评分为0至1；经组织学或细胞学诊断为IIIB-IV期NSCLC；驱动基因（EGFR/ALK/ROS1）阴性且基于肿瘤组织标本检测PD-L1肿瘤比例评分（Tumor proportion score, TPS）≥1%；根据实体瘤疗效评价标准1.1版（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.1, RECIST 1.1）至少有一个可测量病灶；器官功能充足；预期寿命超过3个月并签署书面知情同意书；初治患者；以及脑转移患者必须是无症状且未接受过脑转移治疗的。排除标准包括：活动性出血或有出血风险；有临床意义的出血史或需要治疗性抗凝；对研究药物过敏或可能过敏；围产期女性；以及同时参加另一项干预性临床试验。详细的纳入和排除标准见支持信息S1。PD-L1表达分析通过免疫组织化学在肿瘤组织上进行。TPS定义为显示任何强度部分或完全膜染色的存活肿瘤细胞的百分比。驱动基因状态（EGFR、ALK和ROS1）基于肿瘤组织使用聚合酶链反应或下一代测序进行评估。本研究方案获得了连云港市第一人民医院伦理委员会的批准（KY-20220105001-01）。所有患者在入组前均签署了知情同意书。患者接受恩沃利单抗（300 mg，每3周一次）皮下注射，于每个周期的第一天给药。Rh-endostatin（210 mg）通过输液泵在每个周期的第1-3天进行持续静脉输注（Continuous intravenous infusions, CII），持续72小时。恩沃利单抗联合Rh-endostatin的方案每3周给药一次。患者的治疗持续至疾病进展、不可耐受的毒性、治疗满2年或患者撤回知情同意。在整个研究过程中不允许单药治疗，也不允许调整恩沃利单抗和Rh-endostatin的剂量。本研究中的肿瘤反应根据RECIST 1.1标准进行评估。在基线期（首次治疗前28天内），所有受试者接受了胸腹部盆腔增强计算机断层扫描（Computed tomography, CT）以及脑部增强磁共振成像（Magnetic resonance imaging, MRI）以筛查转移。对于筛选时已知或疑似脑转移的受试者，在研究期间按规定的时间间隔进行随访脑部影像学检查。肿瘤反应从首次给药开始每6周评估一次，48周后每12周评估一次。最初显示放射学进展性疾病的患者，如果临床症状稳定且研究者认为仍可从治疗中获益，可继续研究治疗。然而，需要在至少4周后进行重复放射学评估以确认。安全性通过AEs进行评估，从首次给药开始直至最后一次研究治疗剂量后30天进行监测。AEs根据美国国家癌症研究所常见不良事件术语标准5.0版（National Cancer Institute’s Common Terminology Criteria for Adverse Events version 5.0）进行分级。本研究的主要终点包括ORR（定义为完全缓解[Complete response, CR]和部分缓解[Partial response, PR]的患者比例）和安全性。次要终点包括PFS、DCR、OS、缓解持续时间（Duration of response, DOR）和至缓解时间（Time to response, TTR）。DCR定义为CR、PR和疾病稳定（Stable disease, SD）的患者比例。DOR定义为从首次记录到CR或PR至疾病进展（Progressive disease, PD）或死亡（以先发生者为准）的时间。TTR是从治疗开始到发生CR或PR所经过的时间。在首次治疗前采集血浆样本。使用质谱法对血浆样本进行蛋白质组学分析。详细的实验方法见支持信息S2。使用limma（|log2FC| > 0.585, p < .05）获取两组之间的差异蛋白。通过使用R包“glmnet”进行最小绝对收缩和选择算子（Least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）分析进行数据降维和变量选择。模型指定α = 1（LASSO惩罚项）。为确保可重复性，在分析前设置随机种子为2。进行十折交叉验证以选择最优正则化参数λ。具体而言，选择λ.min（使交叉验证误差最小化的λ值）并应用于得出最终的稀疏模型，仅保留非零系数。通过R包“ROC”绘制受试者工作特征曲线（Receiver operator characteristic curve, ROC curve）以评估蛋白质对肿瘤治疗反应的预测价值。基于KEYNOTE-042研究，该研究调查了帕博利珠单抗（Pembrolizumab）单药治疗在PD-L1阳性NSCLC患者中的疗效，对于PD-L1 ≥50%的患者ORR为39.5%，对于PD-L1 1%–49%的患者约为30%。此外，根据KEYNOTE-189研究，该研究调查了帕博利珠单抗联合化疗治疗晚期NSCLC的效果，帕博利珠单抗加化疗组的ORR为47%，而化疗组为18.9%。本试验的假设是恩沃利单抗加Rh-endostatin的ORR至少为50%。使用精确二项检验进行单比例检验，双侧I类错误（α）为0.1，功效（1-β）为80%，计算得出可评估患者样本量为35例。共33名接受至少一剂研究药物的患者被纳入疗效和安全性评估。招募期末因治疗前撤出导致样本量略低于计算值。连续变量使用中位数和95%置信区间（Confidence interval, CI）进行描述。分类变量以数字和百分比表示。ORR和DCR的95% CI使用Clopper-Pearson法估计。OS和PFS及其95% CI使用Kaplan–Meier法分析。DOR和TTR在数据截止时计算，并附有各自的95% CI。使用SPSS Statistics 26.0、GraphPad Prism v9.4.1和R系统进行统计分析和数据图形化呈现。
研究人员在2022年4月至2024年2月期间，共招募了33名EGFR、ALK和ROS1阴性、PD-L1阳性、IIIB-IV期的NSCLC患者。截至数据截止日期（2024年4月1日），中位随访时间为13.9个月（95% CI, 5.9–21.8个月）。联合治疗的中位持续时间为4.6个月（范围，1.4–21.8个月），对应中位6个治疗周期（范围，2–31周期）。在33名患者中，仍有11名（33.3%）在接受研究治疗。治疗终止的最常见原因是疾病进展（12名患者）、不可耐受的毒性（4名患者）和患者撤回知情同意（6名患者）。六名患者撤回知情同意的原因如下，并非由治疗相关毒性驱动：一名患者在达到确认的PR且肿瘤显著缩小超过16个月的治疗后无不适，选择停止积极抗肿瘤治疗。另一名患者在治疗近4个月后撤出，拒绝进一步住院治疗并选择替代口服方案。其余四名患者在治疗2-3个月后主要因交通不便（前往研究中心路途遥远）而停止，并选择在当地医院继续治疗。患者的中位年龄为69岁（范围，59-80岁）。其中，26名患者（78.8%）为男性，7名（21.2%）为女性。45.5%为鳞状细胞癌，54.5%为非鳞状细胞癌。14名患者（42.4%）的ECOG PS评分为0，19名患者（57.6%）的ECOG PS评分为1。26名患者（78.8%）PD-L1低表达（TPS：1%-49%），7名患者（21.2%）PD-L1高表达（TPS ≥50%）。11名患者（33.3%）为IIIB-IIIC期疾病且均拒绝标准放化疗故被招募，22名患者（66.7%）为IV期疾病，包括3名脑转移患者。所有患者治疗前的临床数据见表1。
在33名患者中，16名观察到PR，11名观察到SD，6名观察到PD。ORR为48.5%，DCR为81.8%（表2）。值得注意的是，24名患者观察到肿瘤缩小（图1）。中位TTR为2.5个月（95% CI, 1.3–3.2），中位DOR未达到，表明疗效持久（表2）。在16名PR患者中，8名仍在接受治疗，而在11名SD患者中，有3名仍在接受治疗。截至数据截止时，12名患者（36.4%）发生了PFS事件，中位PFS为12.3个月（95% CI, 3.1个月–21.5个月）（图2A）。中位OS未达到，1年OS率为73.9%（图2B）。在亚组分析中（表3），7名PD-L1高表达（TPS ≥50）患者的ORR和DCR分别为71.4%和100%。在26名PD-L1低表达（TPS 1%–49%）患者中，ORR和DCR分别为38.5%和76.9%。在11名IIIB至IIIC期患者的亚组中，ORR和DCR分别为63.6%和90.9%，而在22名IV期患者中，ORR和DCR分别为40.9%和77.3%。PS = 0和PS = 1的患者亚组中观察到相似的ORR和DCR（分别为57.1% vs. 42.1%和78.6% vs. 84.2%）。在不同年龄组（<70 vs. ≥70，47.1% vs. 50%）和病理类型（鳞状细胞癌 vs. 腺癌，46.7% vs. 44.4%）中也观察到一致的ORR。在三名脑转移患者中，一名达到PR，一名SD，一名PD。
在33名患者中，25名（75.8%）患者经历了各种级别的TRAEs。最常见的TRAEs是低钠血症（21.2%）、疲劳（21.2%）和贫血（18.2%）（表4）。3级TRAEs发生在6名患者（18.2%），3级TRAEs包括疲劳（6.1%）、低钾血症（6.1%）、发热（3.0%）、超敏反应（3.0%）、丙氨酸氨基转移酶升高（3.0%）、天冬氨酸氨基转移酶升高（3.0%）和γ-谷氨酰转移酶升高（3.0%）。在irAEs中，甲状腺功能亢进症（6.1%）最常见，其次是甲状腺功能减退症（3.0%）和免疫性肝损伤（3.0%）。值得注意的是，未报告4级或5级AEs，也无TRAEs导致的死亡。三名患者（9.1%）经历了与抗血管生成治疗相关的出血事件，包括一名2级咯血和1级粪便隐血的患者，一名1级咯血患者，以及另一名1级粪便隐血患者。仅有一名患者因出血事件停止治疗，未发生3级或更高级别的出血事件。鳞状NSCLC和非鳞状NSCLC患者的出血发生率相似（分别为6.7%和11.1%）。由于治疗期间出现毒性，四名患者（12.1%）停止了治疗方案。其中，一名患者因3级过敏反应停止治疗，一名患者因3级发热停止治疗，一名患者因3级肝损伤停止治疗，另一名患者因2级咯血停止治疗。
研究人员对基线血浆进行了蛋白质组学分析，以区分应答者（Responders, CR和PR）和非应答者（Nonresponders, SD和PD）。共鉴定出91个差异表达蛋白（Differentially expressed proteins, DEPs）（图3A）。基因本体论（Gene Ontology, GO）功能富集分析显示，DEPs主要富集在与ERK1和ERK2级联正调控、细胞趋化、MAPK级联正调控和白细胞趋化相关的生物过程（Biological processes, BP）中（图3B）。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析鉴定出几个显著富集的通路，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、肌细胞中的细胞骨架、昼夜节律、胆碱能突触、TGF-β信号通路等（图3C）。其中，最显著富集的通路是细胞因子-细胞因子受体相互作用、昼夜节律、胆碱能突触和TGF-β信号通路，它们共同包含12个DEPs：LEFTY1、TNFRSF11E、NBL1、TNFRSF6B、GDF15、NOS1AP、IL16、CCL18、GNG8、GNG2、DCN和CAMK4（图3D,E）。对91个DEPs进行蛋白质-蛋白质相互作用（Protein–protein interaction, PPI）网络分析，鉴定出13个核心枢纽蛋白，包括CD74、HMGN2、PEBP4、GDF15、CHI3L1、MMP1、DCN、BGN、TAGLN、GNG2、GNG8、GCG和SRSF7（图3F）。随后应用LASSO回归，确定了与免疫治疗反应最相关的15种蛋白质：TPRG1L、FHIT、GNA14、TMEM9B、HLA-H、MMP1、SLC35A3、GGT1、LCN1、WDHD1、CHGB、EPDR1、TNFRSF6B、CALCOCO2和TUBB4A（图4A–C）。将这15种蛋白质与KEGG通路中的12种蛋白质和PPI网络中的13种核心蛋白质进行交集分析，发现MMP1和TNFRSF6B是关键候选分子（图4D）。应答者（CR或PR）患者的MMP1表达显著高于非应答者（SD或PD）患者（p = .013）（图5A），而TNFRSF6B在应答组中显著降低（p = .017）（图5A）。MMP1和TNFRSF6B的ROC曲线AUC值分别为0.77（95% CI, 0.61–0.93）和0.68（95% CI, 0.49–0.87）（图5B,C）。使用MMP1和TNFRSF6B的联合预测模型AUC为0.81（95% CI, 0.66–0.96）（图5D），表明该联合模型预测疗效准确性较高。
本研究是首个前瞻性评估恩沃利单抗联合Rh-endostatin治疗初治、驱动基因阴性、PD-L1阳性的晚期NSCLC患者疗效和安全性的II期临床试验。在这项临床试验中，Rh-endostatin联合恩沃利单抗的一线治疗在驱动基因阴性、PD-L1阳性的晚期NSCLC中显示出良好的疗效和耐受性。这些疗效结果优于既往报道的类似人群中一线PD-(L)1抑制剂单药治疗的结果（ORR约为31%–38%；mPFS约为6–8个月）。在PD-L1高表达亚组（TPS ≥50%）中，ORR达到71.4%，表明该联合方案在这些患者中可能发挥更强的抗肿瘤活性。在安全性方面，该方案显示出与含化疗方案不同的毒性特征。与Rh-endostatin加化疗方案相比（后者常见化疗相关AEs，如中性粒细胞减少症[52.4%]和恶心/呕吐[50.6%]），当前这种无化疗的联合方案未观察到这些典型毒性。尽管跨试验比较存在固有局限性，但现有数据表明，恩沃利单抗联合Rh-endostatin可能在维持疗效的同时降低晚期NSCLC的治疗相关毒性，为拒绝化疗的患者提供一种潜在的治疗替代方案。
寻找有效且耐受性良好的无化疗方案至关重要。尽管既往研究探索了如阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗（仅限于非鳞状组织学类型）或信迪利单抗联合安罗替尼（存在显著毒性，如高血压和出血）等组合，本研究引入了一种新颖的治疗策略。该方案显示出可控的安全性，仅18%的患者发生3级TRAEs，且无4级或5级事件。本研究中AEs的发生率也低于信迪利单抗加安罗替尼，后者因不可耐受的毒性而需减量的患者比例为22.7%。近期III期临床试验结果为评估新型组合的安全性提供了重要借鉴。LEAP-007研究凸显了该治疗策略面临的关键挑战；尽管帕博利珠单抗联合仑伐替尼（Lenvatinib）改善了PFS和ORR，但未能实现OS获益，归因于其难以承受的毒性特征（≥3级AEs发生率为57.9%）。这强调了联合方案的临床成功取决于疗效与耐受性之间的良好平衡。相反，HARMONi-2试验确立了PD-1/VEGF双特异性抗体埃万妥单抗（Ivonescimab）的新疗效基准，与帕博利珠单抗单药治疗相比，在保持可控安全谱的同时显示出PFS的改善。尽管无法进行直接的跨试验比较，且我们的样本量有限，但恩沃利单抗加Rh-endostatin可能代表了一种有前景、适用性广的无化疗选择。其良好的耐受性，表现为较低的AEs发生率，可能使其成为优先考虑低毒性治疗方案的患者，包括老年患者的合适选择。
在探索性分析中，基线血浆蛋白质组学分析鉴定出91个DEPs。进一步整合这些DEPs与功能富集、PPI网络分析和LASSO回归，发现MMP1和TNFRSF6B可能是免疫治疗反应的潜在生物标志物。TNFRSF6B是肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor, TNF）受体超家族的诱饵受体，通过多种机制发挥免疫抑制作用。一方面，TNFRSF6B与TL1A和LIGHT紧密结合，阻止它们与各自的受体DR3和HVEM相互作用，从而抑制T细胞活性并抑制促炎细胞因子的释放。因此，它抑制了肿瘤血管正常化和肿瘤免疫微环境的形成。另一方面，TNFRSF6B作为诱饵受体，中和TRAIL和FasL，阻止这些分子与其功能性死亡受体结合。结果，凋亡信号通路被抑制，最终帮助肿瘤逃避免疫攻击。
本研究存在一些局限性。首先，作为一项单臂II期研究，样本量相对较小，且未设立对照组。未来的研究需要更大的样本量和随机对照试验来验证Rh-endostatin与恩沃利单抗联合治疗的疗效和安全性。其次，排除标准仅限于EGFR、ALK和ROS1改变，这符合研究设计时（2021年）的治疗标准。因此，排除标准未涵盖其他可靶向改变，如RET、NTRK或BRAF，针对这些靶点的一线靶向治疗现已成为标准。未来的研究应纳入更广泛的分子检测，以包括那些没有可靶向驱动改变、且已获批一线靶向治疗的患者。第三，本研究中纳入了一些IIIB和IIIC期患者，这可能会延长观察到的中位生存数据。此外，由于本研究中仅有三名患者在治疗前存在脑转移，因此未进行针对脑转移疗效的亚组分析。因此，需要进一步研究来评估该联合治疗方案治疗脑转移的疗效。另一个局限性是缺乏对候选生物标志物MMP1和TNFRSF6B的功能验证。尽管它们与治疗反应相关，但其在此背景下的确切生物学作用仍有待阐明。功能验证研究已作为下一步计划。
总之，这项II期试验提供了初步证据，表明Rh-endostatin与恩沃利单抗联合具有令人鼓舞的疗效和可控的安全性。在关键患者亚组中均观察到抗肿瘤活性，包括老年患者（≥70岁）和不同组织学亚型患者。探索性分析发现MMP1和TNFRSF6B是治疗反应的潜在预测性生物标志物。
