多组学揭示食源性污染物9,10-环氧硬脂酸(9,10-epoxy stearic acid, ESA)致小鼠睾丸毒性的作用机制

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Mechanisms of testicular toxicity uncovered by multi-omics: 9,10-epoxy stearic acid as a foodborne contaminant in mice

　　

摘要：高温烹饪过程会产生9,10-环氧硬脂酸(9,10-epoxy stearic acid, ESA)等氧化脂质，但其生殖毒性尚不清楚。研究人员发现，ESA经口暴露可诱导小鼠产生肝毒性、血清睾酮(testosterone)降低及雄性生殖功能障碍，表现为睾丸损伤、精子发生(spermatogenesis)紊乱及精子质量下降。整合代谢组学与蛋白质组学分析显示ESA扰乱氨基酸与碳水化合物代谢稳态，且两组数据集提示线粒体功能障碍(mitochondrial dysfunction)可能是其毒性的关键因素。ESA激活Bax/Bcl-2介导的线粒体凋亡途径，导致生殖细胞(germ cell)凋亡增加。体外(in vitro)在GC-2spd(ts)精母细胞中验证ESA下调Ndufa4l2和Mettl20等线粒体相关基因，减少ATP生成，抑制线粒体复合物Ⅰ(Complex I)活性并诱导氧化应激(oxidative stress)。ESA还显著下调Cxcr4、Bbof1、Spata25、Sdc1、Rhox5和Foxj3等精子发生必需基因。上述结果表明ESA通过线粒体功能障碍——表现为能量代谢受损、氧化应激升高及内源性凋亡途径(intrinsic apoptotic pathway)激活，并伴精子发生调控基因网络抑制，损害雄性生殖功能。本研究确认ESA为氧化煎炸油中的关键有毒单体，强调应将特定脂质氧化产物纳入食品安全评估。

论文解读：多组学揭示食源性污染物9,10-环氧硬脂酸(9,10-epoxy stearic acid, ESA)致小鼠睾丸毒性的作用机制

该研究发表于《Ecotoxicology and Environmental Safety》。高温烹饪尤其是反复煎炸会使食用油发生热氧化，产生复杂的氧化脂质混合物，既往研究多关注混合物整体毒性，对其中单一生物活性氧化脂质单体的毒理机制缺乏深入探究。9,10-环氧硬脂酸(ESA)是植物油热氧化过程中油酸形成的极性单体污染物，随反复煎炸积累，其作为含亲电环氧基的反应性脂质可与DNA和蛋白质形成加ducts，已有研究提示ESA对肝细胞有细胞毒和促凋亡作用，但对广泛存在于膳食中的ESA是否影响雄性生殖系统尚未见报道。雄性生殖系统对代谢扰动和氧化应激敏感，精子发生(spermatogenesis，生精细胞经有丝分裂、减数分裂及变态发育为成熟精子的多阶段严格调控分化程序)依赖能量代谢、线粒体功能及基因时空表达。此前仅观察到氧化煎炸油可使大鼠精子活力下降、睾酮降低，但具体致毒单体及分子通路不明。基于此，研究人员假设ESA可扰乱睾丸代谢稳态、引起线粒体功能障碍并抑制精子发生相关基因网络，最终致雄性生殖毒性，遂采用体内小鼠模型、体外细胞实验及代谢组—蛋白质组多组学整合策略开展研究。

主要关键技术方法： 研究选用5周龄ICR小鼠（n＝10/组）随机分为对照组（10%牛血清白蛋白BSA灌胃）与ESA处理组（1 mg/kg ESA经口灌胃，连续58天，覆盖约1.7个小鼠生精周期），检测血清生化与睾酮、睾丸脏器系数、精子参数（计算机辅助精子分析CASA）及组织病理（H&E染色、Johnsen评分）、TUNEL凋亡检测、Western blot；取睾丸组织行非靶向液相色谱—质谱代谢组学(LC-MS metabolomics)与4D数据非依赖采集蛋白质组学(DIA proteomics)，进行OPLS-DA、KEGG与GO富集及蛋白互作(PPI)网络分析，整合共有通路并做Pearson相关性分析；体外培养小鼠精母细胞系GC-2spd(ts)，给予不同浓度ESA（50、100、200 μM，24 h），检测细胞活力(CCK-8)、乳酸脱氢酶(LDH)释放、线粒体膜电位(MMP，JC-1探针)、胞内活性氧(ROS，DCFH-DA探针)、ATP含量及线粒体呼吸链复合物Ⅰ(Complex I)活性，并以qRT-PCR验证睾丸组织与细胞中差异表达基因。

3.1. ESA exposure triggered body weight gain and hepatotoxicity in mice（ESA暴露引起小鼠体重增长及肝毒性）： 经58天ESA灌胃，小鼠体重增幅高于对照；肝脏见轻度炎细胞浸润，Western blot示肝组织IL-1β和IL-6上调而TNF-α无变化，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高、天冬氨酸氨基转移酶(AST)无变化，血尿素氮(BUN)与血肌酐(Scr)正常，血清睾酮显著降低。表明ESA促进体重增长，诱导肝脏炎症与功能损伤，并干扰雄激素稳态。

3.2. ESA exposure induced testicular damage and impaired sperm quality in mice（ESA暴露致小鼠睾丸损伤及精子质量下降）： ESA组睾丸/体重系数降低，生精小管管腔增宽、Johnsen评分下降，生精上皮TUNEL阳性细胞增多，Bax上调、Bcl-2下调致Bax/Bcl-2比值升高；附睾精子计数与活力（直线性率、直线速度VSL）下降，形态异常（圆头、无尾、颈折叠、卷尾）比例升高。证实ESA破坏精子发生并损害精子质量。

3.3. ESA-induced testicular metabolic disruption in mice（ESA诱导小鼠睾丸代谢扰动）： 睾丸非靶向代谢组OPLS-DA可区分两组，筛选出258个差异代谢物(DEMs，141上调、117下调)。KEGG富集显示酪氨酸代谢、精氨酸生物合成、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢（氨基酸代谢），糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径（碳水化合物代谢）及甘油磷脂代谢显著紊乱，提示ESA所致代谢失衡参与生殖毒性。

3.4. Proteomic insights into ESA testicular toxicity in mice（ESA睾丸毒性的蛋白质组学解析）： 蛋白质组PCA显示两组分离，鉴定225个差异表达蛋白(DEPs，84上调、141下调)；GO富集中线粒体相关类别显著富集（28个线粒体蛋白、6个线粒体基质蛋白）。整合KEGG与PPI提示氨基酸与碳水化合物代谢相关线粒体蛋白改变。qRT-PCR验证Pklr、Ndufa_4l2、Agxt、Arg₁、Mgme₁、Mettl₂₀mRNA与蛋白趋势一致。另筛出12个生精相关DEPs，qRT-PCR确认Cxcr₄、Bbof₁、Spata₂₅、Sdc₁、Rhox₅、Foxj₃在睾丸组织中显著下调。表明多组学共同指向线粒体功能障碍为核心机制，且精子发生调控基因受抑。

3.5. Integrated proteomic and metabolomic analysis of testes in ESA-exposed mice（ESA暴露小鼠睾丸组织蛋白—代谢组学整合分析）： 两数据集共有39条共享通路，氨基酸代谢（精氨酸生物合成；丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢；甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢）与碳水化合物代谢（氧化磷酸化；糖酵解/糖异生）显著聚簇。关键DEP（如Prkag₃、Mettl₂₀、Ogg₁、Acvr_2a、Spata₂₅等）与差异代谢物呈显著相关，反映线粒体β-氧化受损、磷脂代谢紊乱、氧化应激及生精信号通路受扰的协调改变。

3.6. ESA-induced mitochondrial damage and oxidative stress in GC-2spd(ts) cells（ESA诱导GC-2spd(ts)细胞线粒体损伤及氧化应激）： ESA降低GC-2spd(ts)细胞活力、升高LDH释放；JC-1染色示线粒体膜电位(MMP)去极化（红/绿荧光比下降），胞内ATP与线粒体复合物Ⅰ活性降低，DCFH-DA示ROS升高，证实ESA在精母细胞中引致线粒体功能损伤与氧化应激。

3.7. Validation of gene expression levels in ESA-exposed GC-2spd(ts) cells（ESA暴露GC-2spd(ts)细胞基因表达验证）： qRT-PCR示Cxcr₄、Spata₂₅、Sdc₁、Rhox₅、Foxj₃、Ndufa_4l2在各浓度ESA下均显著下调，Bbof₁在200 μM下调，Mettl₂₀在100和200 μM下调，Pate₄无变化，与体内睾丸组织差异表达趋势吻合。

讨论与结论： 研究人员指出，ESA作为氧化煎炸油中毒性单体可致小鼠肝毒性、系统性炎症及血清睾酮降低，其雄性生殖毒性源于直接睾丸损伤与继发全身效应（肝功能障碍影响下丘脑—垂体—性腺轴HPG axis）的共同作用。ESA引起生精小管管腔扩张、生殖细胞Bax/Bcl-2介导线粒体凋亡途径激活、精子数量/活力下降及畸形率升高；代谢组与蛋白质组均揭示氨基酸（甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、精氨酸生物合成、酪氨酸代谢）、碳水化合物（糖酵解、磷酸戊糖途径、氧化磷酸化）及脂质代谢失调，并汇聚于线粒体功能相关蛋白改变——包括Ndufa_4l2（复合体Ⅳ accessory亚基）与Mettl₂₀（线粒体赖氨酸甲基转移酶，修饰电子传递黄素蛋白调控脂肪酸β-氧化）下调伴随ATP减少与复合体Ⅰ活性降低。同时Cxcr₄、Bbof₁、Spata₂₅、Sdc₁、Rhox₅、Foxj₃等精子发生关键基因被抑制。体外实验验证了ESA致精母细胞线粒体膜电位丧失、ROS升高及能量危机。研究局限包括ESA剂量基于体外细胞毒性和同类食源毒物参考尚需人群暴露数据佐证、未设多剂量梯度及长期可逆性评估、未能区分ESA是直接经血作用于睾丸还是经肝代谢产物间接作用、未明确靶细胞类型（生精细胞/Sertoli细胞/Leydig细胞）。结论为：膳食热加工产生的氧化脂质单体ESA通过诱发线粒体功能障碍（能量代谢受损、氧化应激增强及内源性凋亡途径激活）并抑制精子发生调控基因网络，损害雄性生殖功能；应将特定脂质氧化产物如ESA纳入食品安全风险评估范畴。