在Oryzias latipes中开发了一种基于CRISPR/Cas9的单性繁殖策略，用于鱼类养殖领域

《Aquaculture》：CRISPR/Cas9-based mono-sex breeding strategy developed in Oryzias latipes for applications in fish

　　

Jinzhi Zhao|Lei Chen|Yi Rong|Yanlong Song|Binbin Tao|Ji Chen|Wei Hu

中国科学院水生生物研究所育种生物技术与可持续水产养殖国家重点实验室，中国湖北省洪山实验室，武汉430072

摘要

单性培养是一种可以显著提高许多经济重要鱼类物种经济效益的繁殖策略。传统的单性诱导技术要么耗时且劳动密集，要么效率低下，而新兴技术仍需进一步优化。在本研究中，使用青鳉（Oryzias latipes）作为模型，探索基于CRISPR/Cas9系统的可诱导单性繁殖策略。以DMY基因作为编辑目标，建立了两个转基因青鳉品系——Tg (β-actin: Cas9) 和 Tg (U6: DMY gRNA)。在这些转基因品系杂交产生的后代中，由于DMY突变，81%的遗传上为雄性的个体发生了性别逆转，成为生理上的雌性。通过生殖腺切片和定量PCR分析表明，这些性别逆转的雌性与野生型雌性在生殖腺指数（GSI）、体重或卵巢中I期、II期和III期卵子的比例组成方面没有显著差异。此外，与性别分化相关的基因dmrt1、foxl2和cyp19a1的表达水平也没有显著差异。利用这一策略，获得了雌性比例约为89%的青鳉群体。总体而言，本研究为开发大规模、特定物种和精确的单性繁殖技术提供了新的见解。

引言

对于经济重要的鱼类物种，由于性别特异性的表型差异，通常有对单性群体的需求。一些养殖鱼类，如鲤鱼（Cyprinus carpio）和黄鲶鱼（Pelteobagrus fulvidraco），在生长方面表现出性别二态性（Mei和Gui，2015年），而其他物种如鲟鱼（Acipenseriformes）和河豚（Takifugu rubripes）主要因其生殖腺产品（例如鱼子酱和shirako）而被消费（Falahatkar等人，2014年；Shen等人，2023年）。对于这些物种，培养单性群体可以显著提高经济效益，因此在水产养殖繁殖中是一个重要的策略（Tao和Hu，2022年）。

产生单性鱼类的传统技术包括生殖内分泌调控和细胞工程。生殖内分泌调控通常涉及性激素处理，以获得与其遗传性别不同的生理性别亲本鱼，也称为XX假雄性或ZZ假雌性，当与野生型XX雌性或ZZ雄性杂交时，会产生单性后代群体。这种方法具有高效性和稳定性，已应用于鲤鱼、黄鲶鱼、黑线鳕（Anoplopoma fimbria）和黄鲷鱼（Larimichthys crocea）（Wu等人，1990年；Yang等人，2018年；Luckenbach等人，2017年；Mu等人，2024年）。然而，需要持续施用性激素来维持亲本的繁殖能力，这既耗时又费力，并且存在污染水生环境的风险。细胞工程技术，如雌核发生，即用失活精子激活卵子，然后通过热休克或高压处理等方法使卵子二倍化，可以产生全雌性幼鱼（Luo等人，2011年；Jiang等人，2018年）。然而，雌核发生和雄核发生通常表现出二倍化效率低、诱导条件不稳定以及胚胎畸形和死亡率高。

利用新兴方法针对影响鱼类性别分化的遗传和环境因素，例如对性别相关基因的基因操作或调节幼鱼的发育环境，已被应用于鱼类性别控制。例如，在尼罗罗非鱼（Oreochromis nilotica）中过表达dmrt1基因可以诱导雌性向雄性的性别逆转（Wang等人，2010年），并通过靶向编辑性别决定基因amhy可以获得全雌性的尼罗罗非鱼群体（Li等人，2015年）。保持较高的环境温度也可以产生雄性比例较高的幼年鲤鱼群体（Biswas等人，2021年）。然而，这些策略往往受到高效繁殖单性群体的共同挑战的限制。

近年来，提出了一种可诱导的基因编辑策略，并已成功应用于家蚕（Bombyx mori）和小鼠的性别控制。在家蚕中，建立了两个转基因品系：一个在W染色体上携带nos: Cas9表达盒，另一个表达dsx gRNA。这两个品系杂交产生的ZW雌性胚胎由于dsx基因突变而死亡，该基因对发育至关重要（Zhang等人，2018年）。在小鼠中，通过在X染色体或Y染色体上插入U6: Top1 gRNA表达盒构建了一个转基因品系，而另一个品系表达Cas9。因此，由于Top1基因突变，杂交产生的后代要么是雌性要么是雄性（Douglas等人，2021年）。尽管这种策略克服了单性亲本无法产生后代的限制，但产生的单性群体是以消除相反性别的代价获得的，这阻碍了水产养殖中的大规模幼鱼生产。

然而，基因编辑技术尚未应用于产生单性鱼类。在本研究中，我们旨在通过编辑DMY基因来生产全雌性的日本青鳉（Oryzias latipes），DMY是青鳉中决定性别的基因（Matsuda等人，2002年）。其原理是使用两个转基因品系，一个携带β-actin: Cas9表达盒，另一个表达DMY gRNA，并检查这两个转基因品系杂交产生的后代中的性别逆转情况。

章节片段

材料与方法

本研究中使用的青鳉来自一个橙色品系。所有鱼类都在标准实验室条件下饲养（恒定温度26°C，16小时光照，8小时黑暗）。所有程序和实验方案均符合《实验室动物护理和使用指南》的要求，并得到了中国科学院水生生物研究所的批准（批准编号：IHB 2013724）。

建立U6: DMY gRNA转基因品系

在本研究中，选择dmc1作为目标基因，以评估候选青鳉U6启动子的转录活性。体外合成的gRNA诱导的突变率为41.67%。U6-P1、U6-P2、U6-P3和U6-P5能够在体内驱动dmc1 gRNA的转录。在这些启动子中，U6-P1诱导的突变率最高（63%），因此被选为建立转基因品系（图1A和B）。

DMY基因的第1和第2外显子中有三个目标位点

讨论

在本研究中，以青鳉为模型，我们尝试基于CRISPR/Cas9基因编辑系统建立鱼类单性繁殖技术。在Tg (β-actin: Cas9) 和 Tg (U6: DMY gRNA) 转基因鱼杂交产生的后代中，Cas9在gRNA的指导下诱导了DMY基因的突变，从而导致81%的遗传上为雄性的个体发生性别逆转，最终获得了雌性占89%的群体。

CRediT作者贡献声明

Jinzhi Zhao：撰写——初稿、验证、方法学、研究。Lei Chen：方法学。Yi Rong：方法学。Yanlong Song：资源获取。Binbin Tao：资源获取、资金筹集。Ji Chen：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、概念化。Wei Hu：撰写——审阅与编辑、监督、资金筹集、概念化。

资助

本工作得到了中国国家重点研发计划（2024YFD2402600）和国家自然科学基金（31721005）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。