整合转录组与表观基因组谱揭示系统性自身免疫病中保守的分子亚型

《Annals of the Rheumatic Diseases》：Integrated transcriptomic and epigenomic profiling reveals conserved molecular subtypes across systemic autoimmune diseases

　　

目的：类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)及原发性舍格伦综合征(pSS)常共享重叠的临床特征，但在器官受累及严重程度方面存在显著的病内异质性。本研究旨在明确上述系统性自身免疫病(SADs)中保守的分子亚型，并阐明其转录及表观遗传基础。方法：研究人员对262例未接受过治疗的中国汉族患者(RA：n=109；SLE：n=69；pSS：n=84，女性占83.2%)进行分组，分为发现队列(n=119)与验证队列(n=143)。采用Bulk RNA测序(RNA-seq)定义分子亚型并与临床表型关联；通过转座酶可及染色质高通量测序(ATAC-seq)及靶向切割与标记测序(CUT&Tag)绘制染色质可及性与超级增强子(super-enhancer, SE)图谱；并行进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)以解析各亚型特异的细胞组成。结果：整合分析发现两个稳健且可重复的分子亚型——巨核细胞(megakaryocyte, MK)富集亚型与B细胞富集亚型，在三病种及两队列中均一致存在。巨核细胞富集亚型伴更高血小板计数、更高疾病活动度及更广泛器官受累。表观基因组学分析鉴定出各自特异的染色质可及性与调控架构：巨核细胞富集亚型中巨核细胞相关基因(如ZFP36L1、RAD51B)与活性超级增强子相关联，B细胞富集亚型中B细胞相关基因(如MAF、PRDM1)亦然。scRNA-seq证实相应亚型分别存在产血小板巨核细胞扩增及B细胞活化信号增强。结论：整合多组学分析界定了RA、SLE及pSS中两种具保守细胞与调控程序的分子亚型。该跨疾病分类学可为SADs的精准分层及谱系靶向治疗开发提供依据。尚需多中心验证并进一步探究分子亚型背后的表观遗传机制。

论文解读：《Annals of the Rheumatic Diseases》—整合转录组与表观基因组谱揭示系统性自身免疫病中保守的分子亚型

研究背景与立项依据

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)及原发性舍格伦综合征(primary Sj?gren's syndrome, pSS)是最常见的系统性自身免疫病(systemic autoimmune diseases, SADs)，三者共享重叠的临床表现、自身抗体谱及免疫病理基础，但也存在显著的病内异质性（intradisease heterogeneity），表现为器官受累模式与疾病严重程度的差异。既往各病种单独进行的分子分型未能捕捉SADs间共有的免疫失调本质；虽有研究发现跨SADs存在炎性、淋巴样、Ⅰ型干扰素(interferon, IFN)及未定义四类分子分型，但其转录–表观遗传调控关系及细胞起源仍不明确，限制了临床转化。因此，研究人员通过开展跨疾病的整合多组学分析，旨在识别超越传统诊断边界、具有保守性的分子亚型，并解析其表观遗传调控与细胞组成基础，以为精准分层与靶向治疗提供依据。

主要关键技术方法

研究人员收集未接受治疗的RA(n=109)、SLE(n=69)、pSS(n=84)中国汉族患者外周血，分离外周血单个核细胞(PBMCs)，分为发现队列(n=119)与验证队列(n=143)，并以健康对照(n=20)作参照。主要技术方法包括：(1) 对所有PBMCs行Bulk RNA测序(RNA-seq)进行共识聚类界定分子亚型；(2) 选取代表性样本行转座酶可及染色质高通量测序(assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing, ATAC-seq)及靶向切割与标记测序(cleavage under targets and tagmentation, CUT&Tag)检测H3K27ac、H3K4me3、H3K27me3修饰及染色质开放度，并通过ROSE算法鉴定超级增强子(super-enhancer, SE)；(3) 对独立小队列PBMCs进行单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)，利用Scissor算法将Bulk亚型映射到单细胞水平；(4) 流式细胞术验证巨核细胞及B细胞/浆细胞比例；(5) 整合临床及血清学数据做关联分析。

研究结果

Two consensus molecular subtypes across diseases in the discovery cohort（发现队列中跨疾病一致的两个分子亚型）

研究人员对发现队列行差异表达及共识聚类分析，发现两个稳定亚型C1(n=59)与C2(n=60)，均衡含RA、SLE及pSS样本，说明分子特质超越临床诊断。C1高表达血小板相关基因(PPBP、GP9、PF4、TREML1、CXCL5)，富集伤口愈合、止血、凝血及血小板活化通路，转录因子分析示巨核细胞系调节因子(GATA1、MEIS1、GFI1B、KLF1等)激活，细胞反卷积(xCell、CIBERSORT及WebCSEA)示巨核细胞/血小板特征富集；C2高表达免疫球蛋白基因(IGHV、IGKV)，富集IgG产生及适应性免疫效应过程，转录因子示PRDM1、REL、STAT1上调，细胞反卷积示初始B细胞及浆细胞富集。研究人员将其命名为巨核细胞(megakaryocyte, MK)富集亚型(C1)和B细胞富集亚型(C2)。

Molecular subtypes are reproducible in an independent validation cohort（独立验证队列中分子亚型的重现性）

在验证队列(143例)中聚为C1(n=76)与C2(n=67)，转录景观与发现队列一致——C1持续富集止血/凝血/血小板活化及MK特征，C2持续富集IgG组装/合成及B细胞/浆细胞特征。合并两队列后C1含135例(64 RA、33 SLE、38 pSS)，C2含127例(45 RA、36 SLE、46 pSS)，比例均衡。基于C1高表达5基因(PPBP、GP9、PF4、TREML1、CXCL5)构建Logistic回归模型，在两队列中AUC>0.8，证实分型稳健可预测。

Distinct immune programmes and clinical phenotypes characterise the 2 subtypes（两亚型具 distinct 免疫程序与临床表型）

GSVA评分示C1强活化C–C基序趋化因子受体(CCR)信号及Ⅱ型IFN应答；C2富集Ⅰ型IFN信号、MHCⅠ类分子表达、抗原提呈细胞及T细胞共抑制签名并伴增强的杀伤活性。临床关联分析示验证队列中C1疾病活动度更高——RA简易疾病活动指数(Simplified Disease Activity Index, SDAI)、SLE疾病活动指数(SLEDAI)、pSS欧洲抗风湿病联盟(EULAR)疾病活动指数(ESSDAI)均高于C2。血清学上C1血小板计数及补体C3升高，C2血清IgG显著升高；C1关节炎、内分泌系统及多器官受累更常见。两组年龄、性别、淋巴细胞及中性粒细胞绝对计数无显著差异，排除人口学混杂。

Epigenetic landscape profiling uncovers subtype-specific regulatory programmes（表观基因组图谱揭示亚型特异性调控程序）

CUT&Tag示两亚型较健康对照整体活性组蛋白标记(H3K27ac、H3K4me3)升高，且信号强度呈C1>C2>HC梯度；抑制性标记H3K27me3则C2>C1>HC。ATAC-seq示C1开放染色质区域更广。ROSE鉴定C1特异SE关联巨核细胞分化/造血/血小板活化基因(ZFP36L1、RAD51B、BCL11A、ETV6等)；C2特异SE关联B细胞活化/浆细胞分化基因(MAF、PRDM1、NFATC2、FYB等)。H3K27ac峰基序富集示C1富集SP1、KLF家族(KLF17/KLF3/KLF1)——髓系分化/造血相关，C2富集ETS家族(ETV2/ETV1/ETS1)——B细胞活化相关，从表观调控层面支撑两亚型二分。

Single-cell transcriptome profiling validates subtype-defining cell populations（单细胞转录组验证亚型界定细胞群）

scRNA-seq获得115,848个高质量细胞，分9群：NK细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞、B细胞、巨核细胞(MKs)、低密度粒细胞(LDGs)、CD14⁺单核细胞、CD16⁺单核细胞、树突状细胞。Scissor分析示C1关联MK、LDG及CD16⁺单核细胞的扩增（先天/促血栓免疫态），C2关联B细胞、NK细胞及CD8⁺/CD4⁺T细胞（淋巴系/适应性免疫态）。MK中GATA1/KLF1/MAFB/NFE2高活达，B细胞中IRF9/IRF3/EBF1/BATF高活化。流式验证：C1外周血CD41b⁺CD42b⁺及CD41b⁺CD61⁺MK样细胞比例显著高于HC；C2 CD19⁺B细胞及CD19⁺CD38⁺浆细胞/浆母细胞比例显著高于HC，从蛋白水平正交验证两亚型。

讨论与结论翻译（浓缩自Discussion与Conclusion）

既往RA、SLE、pSS临床重叠但异质性大，需超越传统诊断的分子分型。研究人员通过整合多组学鉴定出跨三病的MK富集与B细胞富集两保守亚型：前者具开放染色质、MK相关SE(ZFP36L1、RAD51B)及MK/血小板扩增，伴高炎症、高疾病活动度及多器官受累，提供血栓风险分层的分子基础；后者具B细胞SE(MAF、PRDM1)、B/浆细胞扩增及Ⅰ型IFN活化，或更适合抗CD20等B细胞靶向治疗。此分类较既往四分型更简约，MK富集亚型融合"炎性"与"IFN"特征，B细胞富集亚型近似"淋巴样"特征且靠近健康对照。局限性含单中心设计需多中心验证、单时间点缺乏纵向治疗动态监测、特定细胞亚群表观精细机制待深入。研究人员总结：整合转录组与表观基因组谱定义RA、SLE及pSS中两保守分子亚型(MK富集亚型与B细胞富集亚型)，各具独特细胞组成与表观调控回路；该跨疾病分类学支持以分子亚型联合传统指标评估疾病活动度（MK亚型中巨核细胞丰度与血小板计数可作补充指标），MK富集亚型多器官受累频率高可用于风险分层，未来需前瞻性多中心队列验证稳定性后方可临床推广，并进一步阐明MK与B细胞中驱动亚型的表观机制。