《ACS Applied Polymer Materials》：PEGylated Nano Lipopolyplexes with Synergistic Lipid Combinations Demonstrate High-Efficiency Nonviral Cellular Delivery of CRISPR/Cas9 Plasmids
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脂质聚合物复合体（lipopolyplexes，LPPs）是一类将脂质、聚合物与RNA或DNA结合的杂化非病毒载体，正逐渐成为mRNA疫苗、基因治疗以及CRISPR/Cas9等核酸治疗的重要平台。然而，不同脂质结构及其理化特征对LPP形成过程的影响仍缺乏充分认
脂质聚合物复合体（lipopolyplexes，LPPs）是一类将脂质、聚合物与RNA或DNA结合的杂化非病毒载体，正逐渐成为mRNA疫苗、基因治疗以及CRISPR/Cas9等核酸治疗的重要平台。然而，不同脂质结构及其理化特征对LPP形成过程的影响仍缺乏充分认识。研究人员系统评估了不同脂质类型对基于阳离子聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）的LPP递送编码Cas9核酸内切酶和单导RNA（single-guide RNA，sgRNA）的质粒DNA（plasmid DNA，pDNA）性能的影响。研究比较了由四类脂质——阳离子脂质、可离子化脂质、阴离子脂质以及中性/促融合脂质——及其组合构建的LPPs，并分析其对转染效率和生物相容性的影响。在所有测试配方中，由阴离子脂质Lecithin和促融合脂质DOPE构成的LPPs，相较于含有阳离子脂质DOTAP和可离子化脂质DODMA的体系，表现出更优异的转染效率和生物相容性。进一步通过加入小比例PEG脂质DMG-PEG进行优化后，获得了领先配方LPP（Lecithin:Chol:DOPE:DMG-PEG），其在HEK293T、PANC1和A549细胞中的转染效率分别达到62.3%、54.4%和52.6%，且体外生物相容性显著改善。该优化LPP的性能显著优于商业化pDNA转染试剂Lipofectamine 3000。以KRAS癌基因为靶标时，Lecithin:Chol:DOPE:DMG-PEG LPP系统在PANC1和A549细胞中分别实现了18.3%和15.6%的基因编辑效率，显示出其作为安全、有效的CRISPR/Cas9基因编辑及其他核酸递送应用非病毒载体的治疗潜力。
该论文发表于《ACS Applied Polymer Materials》，围绕CRISPR/Cas9质粒非病毒递送这一关键瓶颈，系统讨论了聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）基脂质聚合物复合体（lipopolyplexes，LPPs）的组成优化策略。CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）/Cas9基因组编辑技术因具备高精度定点修饰能力，已在基础研究、遗传病干预和肿瘤治疗中展现出重要前景，尤其在肿瘤相关基因和免疫逃逸机制调控方面具有广泛应用价值。然而，这一系统走向临床的主要障碍之一，是如何将CRISPR/Cas9安全且高效地递送进入靶细胞。病毒载体虽在基因治疗中取得进展，但仍受限于免疫原性、载荷容量、重复给药风险、长期安全性和成本等问题。相比之下，非病毒纳米递送系统具有低免疫原性、高载荷能力、设计灵活性和更好安全性，因此成为极具吸引力的发展方向。
在CRISPR/Cas9多种递送形式中，编码Cas9与sgRNA的质粒DNA（plasmid DNA，pDNA）因稳定性较好、制备方便、成本较低而常被优先考虑，但其分子尺寸较大，细胞内转运尤其是入核效率不足，成为应用中的突出难点。研究人员据此将PEI与脂质体结合构建LPP，试图综合利用PEI优异的核酸压缩能力及“质子海绵效应”介导的内体逃逸能力，以及脂质体的膜融合和转染促进作用，从而提升大分子CRISPR/Cas9质粒的递送表现。论文的核心问题在于：不同类别脂质及其组合如何影响PEI基LPP的表面电性、粒径、稳定性、细胞相容性与最终基因编辑性能。
研究人员首先围绕配方比例开展系统优化，确认PEI:pDNA质量比2:1在HEK293T细胞中能够在转染效率与细胞活力之间取得较优平衡；随后进一步比较不同脂质类别在固定PEI:pDNA条件下对LPP性能的影响。所测试脂质包括阳离子脂质DOTAP、可离子化脂质DODMA、中性/促融合脂质DOPE以及阴离子脂质Lecithin，并进一步考察其与胆固醇（cholesterol，Chol）和DOPE的不同组合。结果显示，单纯依赖阳离子或可离子化脂质虽然可维持较高正电荷，但往往伴随更明显的细胞毒性；而阴离子脂质和促融合脂质的合理联用则更有利于兼顾转染效率与生物相容性。尤其是Lecithin:Chol:DOPE组合，表现出最优的综合性能，提示“电荷屏蔽+膜融合促进”的协同机制是该体系发挥作用的关键。
为进一步提升性能，研究人员在Lecithin:Chol:DOPE配方中引入PEG化脂质DMG-PEG，考察PEG化（PEGylation）程度对转染与相容性的影响。结果表明，低比例PEG脂质，尤其1% DMG-PEG，可显著提高转染效率，而不降低细胞活力；但PEG比例过高则因空间位阻效应导致转染效率下降。最终确定的优化配方Lecithin:Chol:DOPE:DMG-PEG在HEK293T、PANC1和A549细胞中均显示出优于商业试剂Lipofectamine 3000的质粒递送能力，并在KRAS突变肿瘤细胞中实现了可观的基因编辑效率。这一结果说明，合理设计的PEI基LPP不仅能够改善pDNA递送，也具备服务于肿瘤相关基因编辑的潜在转化价值。
就主要技术方法而言，研究主要采用以下几类关键手段：首先，基于薄膜水化法制备不同脂质组成的脂质体，并与PEI/pDNA复合形成LPP；其次，利用动态光散射（dynamic light scattering，DLS）、Zeta电位分析和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）对颗粒粒径、表面电荷及形貌进行表征；再次，在HEK293T、PANC1和A549细胞系中通过流式细胞术和荧光显微镜评估GFP标记Cas9质粒的转染效率，并通过MTT法检测细胞活力；最后，采用错配突变检测分析（mismatch mutation detection assay，MDA）、Sanger测序与TIDE（Tracking of Indels by DEcomposition）分析评估KRAS位点基因编辑效率。样本来源主要为ATCC来源的标准细胞系，包括HEK293T、PANC1和A549。
以下结合论文结果部分各小标题进行归纳解读。
Compositional Ratio Optimization of PEI-Based Lipopolyplexes
这一部分首先回答了LPP体系中最基础但最关键的问题，即PEI与pDNA、脂质与PEI/pDNA三者之间的质量配比如何影响递送结果。研究发现，PEI:pDNA从1:1提高至2:1时，HEK293T细胞中的转染效率显著提升，但进一步提高到3:1或4:1并未带来明显增益，反而因PEI阳离子密度增加导致细胞活力明显下降。因此，2:1被确定为后续实验的最优PEI:pDNA质量比。在进一步比较不同脂质体系时，研究人员发现DOPE:Chol配方的转染性能优于DOTAP:Chol和DODMA:Chol体系，而Lecithin和DOPE相关配方在脂质:PEI:pDNA为5:2:1时达到最佳转染水平。由此得出结论：LPP性能高度依赖组成比例，过量脂质可能因过度屏蔽影响细胞膜相互作用，而适中的配比有助于在核酸压缩、表面屏蔽和膜相容性之间取得平衡。
Morphological and Surface Charge Properties of LPPs
这一部分通过TEM和DLS证明了所构建纳米颗粒的形成特征。脂质体呈球形囊泡结构，直径多小于200 nm；PEI/pDNA polyplex则为电子密度更高的致密颗粒；二者复合后形成的LPP粒径大致位于150–300 nm之间，并在高倍下可观察到polyplex位于脂质体表面，从形态学上支持了杂化纳米结构的形成。该结果表明，研究所建立的体系在尺寸上适于细胞摄取，并具备典型脂质-聚合物复合纳米颗粒特征，为后续生物学评价提供了结构基础。
Surface Charge Properties of LPPs Made of Different Types of Liposomes
该部分重点分析不同脂质组成对LPP表面电性的影响。阳离子脂质DOTAP和DODMA构建的脂质体具有较高正Zeta电位，而Lecithin、DOPE及其组合构建的脂质体则表现为负电位。与带正电的PEI/pDNA polyplex复合后，所有LPP体系的电位均向更正方向偏移，说明脂质体与polyplex之间存在明显静电作用。值得注意的是，阴离子脂质体系在复合后表现出更强的电荷中和效应，表面电位趋于中性或适度正电，这种“电荷屏蔽”特征被认为与较好的细胞相容性密切相关。随着脂质:PEI:pDNA比例提高，阴离子Lecithin:Chol:DOPE体系的表面电荷由强正逐渐转向近中性甚至负电，进一步证明脂质组成可精细调控LPP表面理化性质。
Study of Transfection Efficiency and Cell Viability of Lipopolyplexes Prepared Using Different Types and Combinations of Lipids
这一部分是论文的核心比较实验。研究人员在HEK293T细胞中系统比较了不同脂质组合LPP的转染效率与细胞活力。结果显示，DOTAP:Chol、DODMA:Chol与Lecithin:Chol等配方的转染效率相对较低，而含DOPE的体系总体表现更优。尤其是Lecithin:Chol:DOPE配方，其转染效率最高，接近PEI/pDNA polyplex本身，但细胞毒性显著低于polyplex和阳离子脂质体系。与此同时，基于DOTAP或DODMA的LPP因表面正电荷过高而表现出更强细胞毒性。该部分清晰表明，单纯提升正电荷并不能带来最佳递送结果；相反，Lecithin介导的电荷屏蔽与DOPE介导的促融合效应相结合，才能同时实现高转染和低毒性。
Effect of PEGylation on Anionic Lipids-Based Lipopolyplexes
在锁定Lecithin:Chol:DOPE为优势配方后，研究继续考察PEG化修饰的影响。结果表明，加入DMG-PEG后，脂质体及其对应LPP仍维持阴性或近中性的表面电荷，说明PEG化并未显著改变该体系的表面电性。然而，在功能上，1%–2.5%的DMG-PEG可显著增强转染效率，其中1%时达到峰值；而5%–10%时转染能力反而下降。细胞活力在各PEG化比例下均保持良好。说明适度PEG化有助于提高胶体稳定性、减轻聚集并优化细胞相互作用，但过量PEG会产生空间位阻，削弱内吞或膜接触效率。
Influence of Lipid Composition on Transfection Efficiency of Anionic LPPs
这一部分进一步比较了不同阴离子/促融合脂质组合在加入1% DMG-PEG前后的转染表现。结果显示，PEG化对Lecithin:Chol、DOPE:Chol和Lecithin:Chol:DOPE三类配方均能提升转染效率，其中同时含Lecithin和DOPE的配方提升最明显，转染效率可由约40%提高至约58%–60%，优于其他所有阴离子相关体系。这一结果进一步支持组合设计优于单一成分设计，也说明PEG化增益建立在基础脂质协同作用之上，而非简单由PEG本身独立驱动。
Study of Gene-Editing Efficiency of the Lipopolyplexes in HEK293T
该部分将观察终点从GFP表达层面的转染成功，推进至KRAS位点编辑层面的功能验证。利用错配突变检测分析，研究人员比较了不同LPP在HEK293T中的基因编辑效果。结果显示，DOPE:Chol和Lecithin:Chol:DOPE体系在已测试配方中表现稍优，编辑效率分别为9.4%和9.1%。虽然这一水平低于相应转染效率，但证明了递送进入细胞并表达Cas9/sgRNA后，确实可在靶位点产生indel（插入缺失）突变。
Gene-Editing Efficiency of LEC:Chol:DOPE:DMG-PEG Lipopolyplexes in PANC1 and A549 Cells
这一部分展示了最终优化配方在KRAS突变癌细胞中的关键验证结果。Lecithin:Chol:DOPE:DMG-PEG LPP在PANC1和A549细胞中的转染效率分别达到53.4%和44.8%，显著优于Lipofectamine 3000；荧光显微镜下GFP信号增强也支持这一结论。更重要的是，在KRAS基因编辑方面，该配方在PANC1和A549中的编辑效率分别达到18.3%和15.6%，同样高于商业试剂。TIDE分析进一步证实，在PANC1细胞中该LPP诱导的indel比例约为18%，而Lipofectamine 3000仅为8.6%。这些结果证明，优化后的LPP不仅提高了质粒摄取与表达，也在功能性基因编辑层面取得了明确优势。
讨论部分围绕“电荷屏蔽—内体逃逸—颗粒稳定性”这一三位一体设计逻辑展开。研究认为，PEI基LPP的性能并非由单一因素决定，而是取决于脂质对表面电荷、膜相互作用、内体逃逸和稳定性的综合调节。阳离子脂质虽然有利于与细胞膜结合，但过高正电荷会增加细胞应激和毒性；Lecithin等阴离子脂质能够有效屏蔽PEI的过量正电，改善相容性。DOPE因其锥形分子几何构型和酸性环境下的促融合特性，有利于内体逃逸和胞质释放。PEG脂质则通过改善胶体稳定性和表面均一性进一步优化递送过程。论文据此指出，理想的LPP应整合这三类作用，而Lecithin:Chol:DOPE:DMG-PEG正体现了这种多机制协同设计原则。
此外，论文也讨论了转染效率与基因编辑效率之间的不完全一致性。即便在PANC1和A549中获得较高转染率，KRAS位点的编辑效率仍明显偏低。这提示pDNA递送成功后，仍受Cas9和sgRNA表达时序、RNP形成效率、核转运、染色质可及性、向导序列特异性、细胞周期状态和DNA修复机制等多重胞内限制。论文据此强调，单纯提高转染率不足以完全转化为更高编辑率，但当前工作已为非病毒CRISPR/Cas9质粒递送提供了重要优化框架。
研究结论部分可译为：本研究系统优化了用于CRISPR/Cas9质粒DNA递送的PEI基脂质聚合物复合体（LPP）平台。优化策略重点评估了不同脂质类别及其组成对PEI基LPP转染效率和生物相容性的影响。所研究脂质包括阳离子脂质DOTAP、可离子化脂质DODMA、促融合辅助脂质DOPE和阴离子脂质Lecithin，并进一步考察了这些脂质与DOPE的组合，随后将PEG化脂质DMG-PEG引入最具潜力的配方中以改善功能性递送。通过详细的形貌学和理化表征，证实形成了尺寸适于细胞摄取的杂化脂质聚合物复合结构。表面电荷是决定细胞相互作用和细胞相容性的关键因素，且受到脂质组成显著影响。高度阳离子化的LPP与更高细胞应激和更低细胞活力相关，而引入阴离子脂质的配方则能够有效屏蔽过量正电荷并改善生物相容性，但该类体系中的转染效率仍取决于具体脂质身份及组合设计。在所有测试配方中，Lecithin:Chol:DOPE在转染效率和细胞活力之间表现出较理想平衡，其细胞相容性优于PEI polyplex，同时保持相当的递送效率。进一步引入优化比例的PEG脂质后，转染效率得到提升且未损害细胞活力。最终优化配方Lecithin:Chol:DOPE:DMG-PEG在KRAS突变癌细胞系中实现了可测量的基因组编辑效率，在相同质粒剂量条件下，PANC-1中达到18.3%，A549中达到15.6%，并达到或超过商业转染试剂的表现。尽管转染效率相对较高，基因编辑效率仍然较低，提示仍存在核转运、转录效率、染色质可及性和DNA修复机制等胞内屏障。总体而言，这些发现强调了LPP设计中理性脂质选择和制剂优化的重要性，并支持该平台进一步发展为非病毒基因组编辑应用工具。
