通过敲除独脚金内酯生物合成基因改造观赏植物洋桔梗的株型结构

《Plant Cell Reports》：Engineering plant architecture in the ornamental species Eustoma grandiflorum by knockout of strigolactone biosynthesis

　　

关键信息：通过基因组编辑CRISPR-Cas9靶向突变独脚金内酯（strigolactone）生物合成基因CCD8，诱导洋桔梗（Eustoma grandiflorum）矮化并增强分枝。
摘要：在观赏植物中，修改地上部株型（shoot architecture）是多个应用场景的主要育种目标；然而，使用常规技术实现这一目标仍具挑战性。独脚金内酯是抑制分枝的植物激素。研究人员旨在利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术培育洋桔梗的独脚金内酯缺陷型突变体。设计了四个靶向类胡萝卜素裂解双加氧酶8（CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 8, EgCCD8）的引导RNA（guide RNAs），并产生了转基因洋桔梗植株。三个独立株系在所有EgCCD8等位基因上携带缺失或插入，表明编辑效率高。两个株系表现出分枝增加和显著矮化。在其中一株系中，T1代无转基因分离株（null segregants）的株高降至野生型（wild-type, WT）水平的47%。与WT相比，分枝数量增加5.0倍，伴随分枝增强，花蕾形成增加1.7倍。这些发现表明，通过基因组编辑靶向突变CCD8可在不影响其他观赏性状的前提下诱导矮化和增强分枝。

观赏植物的株型结构（shoot architecture）是决定其应用价值的关键性状，涉及株高、分枝数量、长度和角度等要素，直接影响切花、盆栽及花坛植物的用途。传统育种方法在精准调控株型方面存在局限性，尤其对于像洋桔梗（Eustoma grandiflorum）这类以切花为主的商业化物种，其分子机制虽已部分阐明，但株型改良仍主要依赖经验性杂交。独脚金内酯（strigolactones）是一类源于类胡萝卜素的植物激素，通过抑制侧芽生长从而调控分枝。已有研究表明，独脚金内酯生物合成或信号通路的突变（如拟南芥max、矮牵牛dad、豌豆rms、水稻d和htd等）可显著增加分枝并改变株高。然而，在观赏植物中利用基因组编辑技术定向修饰独脚金内酯通路以改善株型的研究尚属空白。因此，研究人员以洋桔梗为对象，旨在通过CRISPR-Cas9技术敲除独脚金内酯生物合成关键基因CCD8，评估其作为株型改良靶点的可行性。

研究人员开展了如下研究：首先克隆了洋桔梗的独脚金内酯生物合成基因CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 8（EgCCD8）及其同源基因EgCCD7，明确了其基因结构和表达模式；然后设计四个引导RNA（gRNA）靶向EgCCD8的外显子区域，构建CRISPR-Cas9双元载体，通过农杆菌介导法转化洋桔梗品种‘Light Pink Thumb’，获得三个编辑株系（G1#1、G3#1和G3#2）；进一步对T0和T1代植株进行突变检测和表型分析，包括株高、分枝数、生物量、花蕾数、花瓣尺寸及叶绿素含量等指标，同时利用RT-qPCR分析内源基因表达变化。结论证实，靶向突变EgCCD8可有效诱导矮化和分枝增加，且不影响其他观赏性状，为花卉作物株型改良提供了新策略。论文发表在《Plant Cell Reports》。

本研究依次采用了以下几个关键技术方法：首先，通过简并PCR和cDNA末端快速扩增（RACE）从洋桔梗（品种‘Light Pink Thumb’，购自Fukukaen Nursery and Bulb Co. Ltd.）中克隆EgCCD8和EgCCD7基因全长序列；其次，利用在线工具Focas和CRISPRdirect设计四个gRNA，并通过Golden Gate克隆法将其插入pEgP137-2A-GFP载体，构建CRISPR-Cas9双元表达载体；然后，采用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105）介导的叶盘转化法转化洋桔梗叶片外植体，经潮霉素筛选获得转基因株系；突变检测则结合T7核酸内切酶I酶切初步筛选和Sanger测序确认，并对T1代无转基因分离株（null segregants）进行表型评估，包括株高、分枝数、鲜重、花蕾数、花瓣颜色（L*和C*值）及叶绿素含量（SPAD值）的测量，基因表达分析采用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR），以EgACT为内参。

研究结果部分包括以下四个小标题：
**Genomic structure of EgCCD8 in E. grandiflorum**
通过简并PCR和RACE克隆得到EgCCD8，编码572个氨基酸，与猕猴桃、矮牵牛、豌豆和拟南芥的CCD8同源性分别为83.7%、79.7%、79.3%和66.2%。基于染色体水平基因组序列分析，确认洋桔梗仅含一个EgCCD8拷贝（Egra_v1_Chr36.g41040），另一同源序列Egra_v1_Chr06.g52510位于CCD8进化支外。空间表达分析显示EgCCD8转录本主要富集于根和茎，而EgCCD7在检测的所有器官中均有表达，因此选择表达模式受限且强度高的EgCCD8作为编辑靶点。

**Detection of CRISPR–Cas9-induced mutations in E. grandiflorum**
通过农杆菌转化获得三个编辑株系：G1#1（双等位突变，含1 bp插入和5 bp缺失）、G3#1（双等位突变，含4 bp缺失和26 bp缺失）、G3#2（纯合6 bp框内缺失）。三个株系均无野生型EgCCD8等位基因，而G2#1因gRNA与靶序列存在1 bp错配而未发生突变。T0代中，G1#1和G3#1表型为分枝增加和矮化，G3#2因框内缺失保留功能显示野生型表型。

**Phenotypes of T1 progenies in each EgCCD8-genome-editing line**
T1代无转基因分离株表型分析显示：G3#1株高降至野生型的47%（8 cm vs 17 cm），分枝数增加5.0倍（9.9 vs 2），花蕾数增加1.7倍（15.7 vs 9），且地上部鲜重显著增加；G1#1分枝数增加至5.6，但株高差异较小。叶绿素含量和始花期无显著差异，花瓣尺寸略有减小（G1#1宽度和高度为野生型的77.4%~80.9%，G3#1为82.7%~86%），G1#1花瓣亮度（L*值）增高。G1#1 T1代出现框内突变个体（3 bp或6 bp缺失），其表型与野生型相似，说明Leu90或Ala91缺失不影响EgCCD8功能。

**Expression of endogenous genes in genome-edited E. grandiflorum**
RT-qPCR分析表明，在G3#1 T0植株的根中，EgCCD8转录本几乎无法检出；而EgCCD7在叶片中的表达量较野生型上调12.5倍。此外，生长素生物合成基因EgYUCCA和转运载体基因EgPIN4在叶片中显著上调，赤霉素代谢相关基因EgGA2ox在根中显著上调。这表明EgCCD8功能缺失不仅直接沉默目标基因，还改变了独脚金内酯与其他激素通路相关基因的表达模式。

讨论部分总结了EgCCD8突变与矮化、分枝增强表型之间的强相关性，指出G3#2的框内6 bp缺失未影响酶活性，而G1#1和G3#1的移码突变导致功能丧失。反馈调控方面，独脚金内酯缺陷显著上调叶片中EgCCD7的表达，与矮牵牛茎中PhCCD8上调但根中不受影响的结果存在差异，提示洋桔梗的反馈机制可能具有物种特异性。局限性在于未直接定量独脚金内酯水平（如LC-MS分析）或进行功能互补实验（如GR24处理），因此表型与独脚金内酯缺乏之间的因果关系为间接推断。此外，T1代中78.3%~84.0%的无转基因个体频率高于预期，可能与低萌发率（20%~30%）或PCR假阴性有关，而洋桔梗倍性（2n=2x=72或2n=6x=72）争议也增加了遗传分析的复杂性。尽管如此，研究证明靶向突变CCD8可同时实现矮化和分枝增加，且不损害叶色、花期等观赏性状，花蕾数增加还延长了持续开花期，可能提升观赏寿命。结论部分翻译如下：总之，通过基因组编辑靶向突变CCD8诱导了矮化和增强的分枝，同时未损害其他观赏性状。因此，独脚金内酯生物合成是花卉作物株型改良的一个有前景的育种目标。