转基因钩虫分泌抗河豚毒素人源单链抗体(Transgenic hookworm secretes anti-tetrodotoxin human single chain antibody)

《Nature Communications》：Transgenic hookworm secretes anti-tetrodotoxin human single chain antibody

　　

生物制剂（Biologics，源自活体或细胞系的蛋白及肽类药物）已成为多种疾病治疗的有效手段，但注射给药及频繁用药增加成本并限制依从性，亟需能持续、安全、高效地在宿主体内原位递送生物制剂的创新平台。本研究描述一种生物工程钩虫（hookworm）平台，用于在体制造并递送生物治疗药物。作为概念验证，研究人员将人源单链可变区片段抗体（human single-chain variable fragment antibody, s16-HuScFv）插入锡兰钩虫（Ancylostoma ceylanicum）分泌组（secretome）基因组中。转基因表达未扰动周围基因表达，且可遗传转基因获得证实。s16-HuScFv转基因产物被分泌入宿主循环系统并可部分中和河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）。鉴于可控人类感染的可行性，该疾病非依赖型（disease-agnostic）生物工程钩虫平台提供了一种下一代策略，可通过单次给药在人体内持续产生并递送生物药物数年。

论文解读：转基因钩虫作为活体药物工厂生产并分泌抗TTX人源单链抗体

一、研究背景与意义

生物制剂（Biologics）通常为蛋白或多肽类药物，传统需胃肠外给药且频繁注射，导致患者依从性差、成本高。现有新型递送系统尚难满足长期、稳定、原位体内持续分泌治疗性蛋白的需求。钩虫（hookworm）如锡兰钩虫（Ancylostoma ceylanicum）可在人体内寄生存活数年且引起最小稳态扰动，可控人类感染已在临床证明安全耐受，其天然具高度发达的排泄/分泌（Excretory/Secretory Proteins, ESPs）系统。基于此，本研究提出将钩虫改造为"活体药物生物工厂（living pharmaceutical biofactory）"，通过CRISPR/Cas9介导的基因组安全港（Genome Safe Harbor, GSH）定点敲入（Knock-in, KI），使钩虫持续表达并分泌治疗性人源单链可变区片段（single-chain variable fragment, scFv）——本研究选用抗河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）的s16-HuScFv作为模式分子，验证该平台可行性。该研究成果发表于《Nature Communications》。

二、主要关键技术方法

研究人员采用多组学驱动的基因组安全港（GSH）鉴定流程筛选高表达、具信号肽且位于长基因间区的位点（GSH1与GSH2）；以重叠sgRNA（small guide RNA）与Cas9核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein, RNP）电穿孔（electroporation）导入钩虫卵进行CRISPR/Cas9编程切割；构建含CMV启动子、钩虫ASP-1信号肽（signal peptide）、s16-HuScFv编码序列及双侧600 bp同源臂（homology arms, HAs）的线性双链供体DNA进行同源定向修复（Homology-Directed Repair, HDR）敲入；经PCR及Oxford Nanopore Technology（ONT）测序验证F0代卵、成虫及F1代卵转基因整合与垂直传递；以qRT-PCR与RNA-seq检测转基因表达及邻近基因影响；以Neuro-2a细胞渗透压裂法检测TTX中和活性；以质谱（mass spectrometry）检测仓鼠血清中s16-HuScFv。动物实验使用金仓鼠（Syrian golden hamster, Mesocricetus auratus）感染钩虫幼虫模型。

三、研究结果

Identification, prioritization, and experimental validation of Genome Safe Harbor (GSH) regions（基因组安全港区域的鉴定、优先级排序与实验验证）

通过转录组与基序富集分析，从锡兰钩虫基因组中筛选出两个高转录活性、两侧基因为高表达且具开放染色质的GSH——GSH1（上游ACEY_000382，蛋白二硫键异构酶）与GSH2（上游ACEY_002225，免疫原蛋白3）。以重叠sgRNA/Cas9 RNP电穿孔处理成虫，靶向扩增子测序显示GSH2位点编辑效率（缺失率较对照升高14.1倍）高于GSH1，且indel分布符合预期，故选定GSH2为后续敲入靶点；电穿孔递送效果优于脂质转染（lipofection）。

Recombinant s16-HuScFv mixed with hookworm ESPs neutralizes TTX（重组s16-HuScFv与钩虫ESPs混合可中和TTX）

体外将重组纯化s16-HuScFv与钩虫ESPs共孵育后，以Neuro-2a细胞检测TTX阻断钠通道引起的细胞裂解，结果显示s16-HuScFv呈剂量依赖性中和TTX（P=1.0×10?3），且钩虫ESPs（含多种蛋白酶）不削弱其中和活性（P=0.90及1.0），证明钩虫分泌组环境不影响s16-HuScFv功能。

Engineering and delivery of transgene construct encoding s16-HuScFv（编码s16-HuScFv转基因元件的构建与递送）

测试多个钩虫高丰度ESP信号肽后，选定Ancylostoma sp. ASP-1信号肽驱动分泌，并在翻译起始位点引入Lys-Ile双残基优化翻译效率。构建含CMV启动子–ASP-1–s16-HuScFv–6×His–bGH poly(A)及600 bp双侧同源臂的3.2 kb线性供体。对锡兰钩虫成熟卵筛查24种Neon电穿孔条件，确定Protocol 13（1100 V，20 ms，2脉冲）可获得稳定转基因整合（PCR验证约350 bp、850 bp及1061 bp预期条带）。

Transgenesis and vertical transmission of s16-HuScFv in hookworms（钩虫中s16-HuScFv的转基因构建与垂直传递）

以Cas9 RNP+供体DNA电穿孔处理F0成熟卵，发育为感染期L3（iL3）感染仓鼠，从F0成虫及F1代粪便卵提取gDNA，PCR均扩出预期1061 bp接合区条带（对照无），ONT测序确证精确整合于GSH2位点。证明s16-HuScFv转基因可稳定整合并通过生殖系垂直传递至F1代。

s16-HuScFv expression did not disrupt surrounding gene expression（s16-HuScFv表达未破坏周围基因表达）

qRT-PCR显示转基因卵中s16-HuScFv显著表达（FDR校正P=1.4×10?3），而上下游基因ACEY_002221与ACEY_002225及内参benA、Rab11a/b表达无显著差异（P=0.40、0.43）。RNA-seq（DESeq2）显示仅s16-HuScFv及5个低表达无关基因差异显著，GSH2所在contig上所有基因表达模式在野生型与转基因组高度一致（Pearson r=0.998），表明定点敲入未扰动机能或邻近转录。

TTX neutralization by hookworm-produced s16-HuScFv in hamster serum（钩虫产生的s16-HuScFv在仓鼠血清中中和TTX）

感染转基因iL3的仓鼠血清中经质谱检测到s16-HuScFv肽段（较野生型背景升高4.71倍，P=2.6×10?3）。功能检测显示转基因感染组仓鼠血清可中和约16.3% TTX活性（P=9.1×10??），野生型感染组无中和作用，证实活体钩虫可分泌具功能活性的人源scFv入宿主循环。

四、讨论与结论总结

本研究首次报道对人源钩虫A. ceylanicum进行CRISPR/Cas9介导的定点转基因敲入，建立可遗传、表达并分泌功能性人源抗TTX单链抗体s16-HuScFv的活体生物工厂。研究人员鉴定验证了GSH2为适宜安全港位点，电穿孔优于脂质转染用于RNP/donor递送，ASP-1信号肽可有效引导治疗蛋白进入钩虫分泌途径。转基因插入不影响周围或全局基因表达，转基因钩虫生活周期完整、可垂直传递。感染仓鼠血清中检测到具TTX部分中和活性的s16-HuScFv。鉴于钩虫可在人体内长期定植且可控感染安全，该平台具疾病非依赖特性，单次接种有望持续数年在体内产生并递送各类生物制剂（如抗炎因子、过敏原、GI靶向蛋白等），克服现有微生物递送系统难以长期定植的局限。未来可通过更强启动子、优化分泌信号、血清半衰期延长及生物 containment（自杀基因/诱导型启动子）进一步提升。研究表明钩虫作为下一代活体药物生物工厂具重大转化潜力。

结论翻译：本研究报道将人源钩虫A. ceylanicum基因改造为活体生物工厂，能通过生物工程分泌组产生并递送功能性人源单链可变区片段抗体（s16-HuScFv）。s16-HuScFv源自人scFv噬菌体展示文库，可中和河豚毒素（TTX）并挽救TTX中毒小鼠。本研究鉴定并展示了GSH2作为A. ceylanicum基因组中适于转基因敲入的安全位点，且电穿孔较脂质转染更适于转基因递送。所选ASP-1信号肽可检测分泌，转基因插入不影响周围或全局基因表达，源自转基因卵的感染期幼虫具正常活力并可完成仓鼠全生活周期，证明转基因对蠕虫适合度无显著影响。F0转基因雌虫产卵经PCR与ONT测序证实为F1转基因卵，表明钩虫中存在垂直传递。结合钩虫生物学及可控感染安全性，工程化钩虫可作为持续缓释药物生产与递送平台。本研究为发展转基因人钩虫药物生物工厂平台、实现在体内持续安全有效地原位递送生物制剂奠定了基础。