CRISPR/Cas9基因编辑在造血干祖细胞中加速细胞疗法和免疫疗法的转化

《Journal of Translational Research》：CRISPR/Cas9 gene editing in hematopoietic stem and progenitor cells to accelerate the translation of cellular therapies and immunotherapies

　　

造血干祖细胞（Hematopoietic Stem and Progenitor Cells, HSPCs）在免疫系统再生中发挥关键作用，并在血液系统疾病和免疫治疗中具有治疗潜力。然而，在HSPCs中进行基因编辑仍然具有挑战性，特别是在小鼠HSPCs中，限制了临床前研究和转化进展。在此，研究人员提出了一种基于CRISPR/Cas9 mRNA的方案，用于高效编辑人CD34⁺ HSPCs和小鼠HSPCs。通过电穿孔Cas9 mRNA和单链向导RNA（single guide RNAs, sgRNAs），研究人员在HSPCs中实现了高达80%的基因敲低，同时保持细胞活力。经编辑的小鼠HSPCs成功重建了致死性照射小鼠的骨髓，显示出功能性植入。研究人员还证明，在小鼠HSPCs和CD34⁺细胞中敲除白细胞介素-6受体（Interleukin-6 Receptor, IL-6R）使髓系分化偏向于免疫抑制性较低的表型，并且将IL-6R敲除的小鼠HSPCs与免疫检查点抑制剂相结合，在临床前模型中增强了胶质瘤治疗疗效，展示了该方法促进细胞疗法转化的潜力。该方法提供了一种可扩展且成本效益高的HSPCs遗传修饰方法，支持造血干细胞移植（Hematopoietic Stem Cell Transplants, HSCTs）和下一代免疫疗法的进展。通过简化临床前和转化应用的基因编辑流程，该方案有潜力加速个性化细胞疗法的发展，并改善肿瘤学和免疫相关疾病的临床结局。

**研究背景与问题**
造血干祖细胞（HSPCs）是免疫系统中唯一具有长期自我更新和多向分化潜能的细胞，可分化产生所有血细胞谱系，因此在血液系统疾病和免疫治疗中具有重要治疗潜力。然而，HSPCs的基因编辑在技术上仍面临诸多挑战，特别是小鼠HSPCs（mHSPCs）因骨髓中数量稀少、体外培养易分化且对基因操作敏感，导致临床前研究和转化进展受限。现有方法（如慢病毒载体）存在半随机插入的安全隐患，且缺乏高效、简便的CRISPR基因编辑方案用于mHSPCs。因此，研究人员旨在开发一种基于Cas9 mRNA的可靠、可扩展方法，以实现对小鼠和人HSPCs的高效基因修饰，加速细胞疗法和免疫疗法的转化。论文发表在《Journal of Translational Research》。

**研究内容与结论**
研究人员建立了一种利用Cas9 mRNA和单链向导RNA（sgRNAs）通过电穿孔对HSPCs进行基因修饰的方案。在mHSPCs中，针对绿色荧光蛋白（GFP）的敲除实现了约80%的基因表达降低；针对IL-6R的敲除使表达下降约4倍，且不影响细胞活力和体外扩增能力。被编辑的mHSPCs在致死照射后成功重建骨髓（100%存活超过75天），并在GL261胶质瘤模型中与抗PD-1免疫检查点抑制剂联合使用时显著提高小鼠生存率。在人CD34⁺ HSPCs中，该方案同样实现了高效的IL-6R敲除（>7.5倍降低），并减少单核髓系来源抑制细胞（MDSCs）的比例。该研究的重要意义在于提供了一种简便、可扩展且成本效益高的HSPCs基因编辑方案，为优化造血干细胞移植（HSCTs）和下一代免疫疗法（尤其是针对脑肿瘤的联合免疫治疗）提供了工具。

**主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术：1）从C57BL/6J小鼠胫骨和股骨骨髓中分离Lin^? mHSPCs，并使用磁珠分选试剂盒（Miltenyi Biotec）去除谱系阳性细胞；从健康供者脐带血来源（LifeSouth Community Blood Centers，美国）获得人CD34⁺ HSPCs，经人CD34 MicroBead Kit超纯试剂盒进行阳性分选。2）使用BTX电穿孔仪（ECM 830），在125 V（5 ms，1脉冲，场强1250 V/cm）条件下，将Cas9 mRNA和sgRNAs（质量比0.76:0.24）混合物电穿孔进入HSPCs。3）通过流式细胞术（BD FACSCanto-II和FACSymphony-A3）检测蛋白表达变化，并使用Sanger测序验证DNA水平基因破坏。4）通过致死照射（9Gy）小鼠骨髓重建实验评估编辑后HSPCs的体内功能，结合GL261胶质瘤模型（C57BL/6J小鼠）和抗PD-1抗体治疗进行疗效评估。

**研究结果**
**Cas9 mRNA-based CRISPR achieves 80% decrease in gene expression in murine HSPCs**
通过优化电穿孔条件（125 V, 5 ms），研究人员在GFP⁺小鼠的Lin^? mHSPCs中递送Cas9 mRNA和靶向GFP的sgRNAs，流式细胞术和荧光成像显示：GFP表达降低80%（5倍），平均荧光强度（MFI）降低>13倍，同时保持较高细胞活力。针对低基线表达的IL-6R基因，使用一种或两种sgRNAs组合均实现约4倍表达下降。

**Gene-modified mHSPCs expand equally as WT-mHSPCs over a 7-day period**
未修饰的mHSPCs在SFEMII+10x培养基中培养7天可扩增7-10倍。比较修饰与未修饰mHSPCs后，未观察到扩增倍数的显著差异，表明基因编辑不影响mHSPCs的体外扩增能力。

**Cas9 mRNA IL-6R KO skews HSPC myeloid differentiation under immunosuppressive culture conditions**
在免疫抑制性培养条件（50% KR158B-luc胶质瘤条件培养基+50% SFEMII+10x）下，IL-6R敲除（KO）的mHSPCs相比野生型（WT）显著增加CD11c⁺MHCII⁺树突状细胞（DCs）比例，同时显著降低CD11b⁺GR-1⁺ MDSCs和CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞比例。与Cas9对照相比，MDSCs和巨噬细胞也呈下降趋势，表明IL-6RKO可逆转胶质瘤条件培养基诱导的免疫抑制性髓系分化。

**Gene-modified mHSPCs retain their reconstitution capabilities**
将0.2×10⁶-0.3×10⁶个修饰或对照mHSPCs输注给接受致死照射（9Gy）的C57BL/6J小鼠后，所有组小鼠在75天内100%存活。这表明经电穿孔修饰的mHSPCs仍保持骨髓重建功能。

**IL-6RKO HSPCs increase overall survival in preclinical glioma**
在GL261胶质瘤模型中，IL-6RKO HSPCs联合抗PD-1抗体治疗组的生存率显著优于WT HSPCs联合抗PD-1组或单独抗PD-1组，证明基因工程化HSPCs具有抗肿瘤治疗潜力。

**Cas9 mRNA is efficacious to modify human CD34⁺ HSPCs**
从健康供者脐带血中分离CD34⁺细胞，体外扩增>4天后进行电穿孔。结果：靶向人IL-6R的sgRNAs组合实现>7.5倍表达下降，细胞活力保持在>55%，CD34表达频率在不同供者中有所变化。在50% U87胶质瘤条件培养基中分化4天后，IL-6RKO的CD34⁺细胞中CD14⁺HLA-DR^lo单核性MDSCs比例显著降低。

**讨论与结论**
讨论部分指出，该研究成功建立了基于Cas9 mRNA和sgRNA电穿孔的HSPCs基因编辑方案，可高效编辑小鼠和人HSPCs，并驱动分化方向改变。与现有方案相比，该协议简洁且实验时间短，利于体内应用。编辑后的mHSPCs活性和扩增能力与未修饰相似，且可成功重建骨髓，并用于多种治疗目的。在人CD34⁺细胞中，编辑虽影响活力和扩增，但IL-6RKO同样可降低免疫抑制性髓系分化表型，提示IL-6R是调节HSPCs分化的重要靶点。该研究还强调了体内移植前需要控制体外扩增和谱系追踪，以降低异常髓系生成或长期干细胞耗竭的风险。由于该技术仅实现了基因敲除，未来将优化用于基因敲入。研究结论（翻译）：该研究旨在建立一种高效敲除HSPCs基因的方法，但未包含向基因组引入供体序列。未来研究将优化HSPCs的高效基因敲入技术。