烟草脆裂病毒介导的无需转基因和组织培养的可遗传基因组编辑

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Virus-induced transgene- and tissue culture-free heritable genome editing in tomato

　　

基因组编辑技术已成为作物基因组操作和性状改良的有力工具。然而，目前最常用的方法依赖于组织培养和转基因材料，这些方法 transcript 费时费力，且通常具有较强的基因型依赖性。研究人员开发了一种基于烟草脆裂病毒（TRV）的递送系统，用于递送紧凑型ISYmu1 TnpB内切核酸酶（一种RNA引导的核酸酶），并结合植株内再生技术，在不同番茄栽培种中实现了无需组织培养的体细胞编辑和可遗传基因组编辑。通过靶向番茄八氢番茄红素脱氢酶基因（SlPDS），研究人员成功在单代内获得了无病毒的纯合突变子代。此外，研究人员将该系统扩展应用于此前功能未知的番茄SlDA1位点的功能分析，揭示了其参与器官大小调控的功能，并获得了无转基因的SlDA1突变体，其果实明显增大。鉴于TRV广泛的寄主范围，该系统应可广泛应用于快速、非转基因且较少基因型依赖性的可遗传基因组编辑，从而推动功能基因组学和作物改良。

基因组编辑技术的出现为加速作物改良提供了巨大潜力，但高效递送基因组编辑试剂以及高效获得无转基因植株仍是该领域面临的两大关键瓶颈。传统植物基因组编辑通常依赖组织培养和农杆菌介导的转化来获取稳定整合编辑构建体的转基因植株，随后还需通过杂交剔除转基因组分，整个过程耗时费力且受限于特定物种和基因型，严重制约了基因组编辑在作物中的广泛应用。为克服这些障碍，研究人员已利用多种植物病毒向表达SpCas9的转基因植株递送单链向导RNA（sgRNA），在双子叶和单子叶作物中实现病毒诱导的基因组编辑（VIGE）。然而，大多数植物病毒难以侵染分生组织，难以接触生殖系细胞，从而限制了产生基因编辑子代的能力。此外，由于多数病毒载体的装载容量有限，这些方法仍需预先通过组织培养和转化获得Cas9过表达株系，并在获得编辑后通过杂交分离转基因组分，流程依然复杂。近期有研究通过工程化改造TRV以递送紧凑型ISYmu1 TnpB核酸酶及其gRNA，在拟南芥中实现了无需转基因的生殖系编辑，但该技术能否应用于作物物种尚不清楚。因此，开发简单、快速、广泛适用且无需组织培养即可获得无转基因可遗传编辑作物的方法仍是该领域的迫切需求。

研究人员建立了基于TRV递送ISYmu1 TnpB内切核酸酶及gRNA的番茄基因组编辑体系。该系统首先靶向SlPDS基因以验证编辑效率及可遗传性，随后应用于此前未被表征的SlDA1位点。SlPDS作为常用的可视标记基因，其突变可导致白化表型，便于快速筛选；而SlDA1的同源基因在其他植物中已被证实参与种子和器官大小调控，但在番茄中的功能尚未明确。研究旨在建立一种绕过组织培养和转基因的一体化策略，为番茄功能基因组学和作物改良提供技术支撑。该研究成果发表于《Proceedings of the National Academy of Sciences》。

研究人员采用的关键技术方法主要包括：利用重组TRV病毒载体通过农杆菌介导的植株注射实现编辑试剂递送；融合番茄突变体FT蛋白（mSlFT）移动性RNA元件增强gRNA的长距离运输能力；通过切除顶端分生组织及腋芽诱导番茄腋芽位点的新生枝条再生；采用Sanger测序和新一代扩增子测序（NGS）检测及定量分析编辑效率与类型；运用逆转录PCR（RT-PCR）和特异性PCR检测子代中病毒RNA及转基因序列的缺失以验证无转基因特性。

**TRV递送ISYmu1实现番茄体细胞基因组编辑。** TnpB核酸酶因其超紧凑尺寸而适于病毒载体完整装载整个基因组编辑试剂。研究人员工程化改造TRV载体以同时表达ISYmu1 TnpB内切核酸酶及其gRNA，并将其与番茄截短突变体FT序列（mSlFT，起始密码子突变）融合，后者被证实可增强gRNA在细胞间的移动能力。研究人员构建了靶向番茄SlPDS基因的pTRV2-TnpB-gRNA^SlPDS-mSlFT载体，通过农杆菌子叶浸润法递送至红樱桃型番茄。浸润三周后，20株植物中有3株（15%）检测到体细胞编辑，系统感染叶片中的插入缺失（indel）频率为0.8%至6.93%。研究人员采集了体细胞编辑效率达6.93%的#17号植株种子以筛选编辑等位基因的可遗传性，但这些体细胞突变未能传递至子代幼苗，原因可能涉及农杆菌递送效率、病毒传播、TnpB活性及工程化TRV RNA2稳定性等多种因素。这些数据表明TRV可递送ISYmu1和gRNA以诱导番茄体细胞基因组编辑。

**通过递送ISYmu1和gRNA^SlPDS诱导基因组编辑的新生枝条的获得。** 研究人员探索了一种可遗传编辑策略，即首先在体细胞中诱导基因组编辑，随后从编辑细胞再生新生枝条。研究人员去除红樱桃型番茄的顶端分生组织及全部腋芽，然后将编码TRV-TnpB-gRNA^SlPDS-mSlFT的农杆菌注射至主茎和腋部区域的所有伤口位点。注射五周后，研究人员观察到腋部区域新生枝条起始或愈伤组织样组织形成，随后从中产生额外枝条，表明新生枝条通过直接或间接再生或两者兼有产生。49株注射植物中，72个新生枝条被起始。其中一个新生枝条（#3）在植株上显示出全白或部分白色区域，与已知的SlPDS突变体表型相似，提示SlPDS基因发生双等位基因突变。Sanger测序证实该枝条三片随机选取的绿色叶片均在靶位点存在5碱基缺失。进一步扩增子测序分析显示该植物绿色叶片中的体细胞编辑效率达56.66%，包含48.51%的5碱基缺失和8.15%的4碱基缺失。随着植株生长，该植物所有花的花瓣均呈白色，但果实未显示白化表型。不同器官的扩增子测序分析显示不同组织呈现 distinct 的突变模式和编辑效率，表明#3枝条为嵌合体，且基因组编辑在该枝条发育后期仍在持续发生。对其余无白化表型的72个新生枝条进行Sanger测序初步筛选，结果表明#7、#17、#43和#70品系出现混合峰，提示基因组编辑已发生。这些品系的扩增子测序分析揭示体细胞突变频率为25.21%至49.69%。值得注意的是，#7和#17枝条似乎携带单一优势缺失，频率约50%，提示这些品系可能对在早期新生枝条发育过程中产生的突变等位基因呈杂合状态。这些数据证明TRV-TnpB-gRNA^SlPDS-mSlFT可在新生枝条中诱导高水平的体细胞编辑。

**通过递送ISYmu1和gRNA^SlPDS实现可遗传的基因组编辑。** 研究人员进一步探究靶向突变是否能够传递至下一代。来自四个品系（#3、#7、#17和#43）的96粒种子被播种于1/2 MS培养基。#3和#17枝条的后代中观察到白化幼苗，提示SlPDS基因存在双等位基因突变。Sanger测序分析显示，#3品系后代的基因型分离比例约为3:1，即28%为5碱基移码缺失的纯合突变体，41%为杂合突变体，31%为野生型，证实亲本植株对该5碱基缺失为杂合状态；#7品系后代中24%为9碱基缺失纯合子，56%为杂合子；#17品系后代中27%为8碱基缺失纯合子，51%为杂合子。而#43品系后代的突变传递率较低，仅2%为3碱基缺失纯合子，26%为杂合子。#7和#43的后代未观察到白化表型，因其分别携带9碱基或3碱基缺失，导致框内缺失。这些结果表明TRV介导的ISYmu1和与mSlFT融合的gRNA递送能够在番茄中诱导可遗传编辑。先前研究表明TRV在植物中不传递给下一代。为验证TRV感染植株子代中不存在病毒，研究人员对#3和#17亲本枝条的各五株白化子代幼苗进行了逆转录PCR。正如所预期的，所有白化后代幼苗中均未检测到TRV和TnpB mRNA信号，且PCR分析进一步表明不存在病毒T-DNA整合，证明TRV-TnpB-gRNA-mSlFT系统能够产生编辑后无病毒和无转基因的子代。

**利用TRV表达ISYmu1和gRNA在不同番茄栽培种中对SlDA1实现高效的体细胞和可遗传编辑。** 为评估该系统是否支持其他基因特别是农艺相关位点的编辑，研究人员靶向了番茄SlDA1基因，其同源基因在其他植物物种中调控种子和器官大小，但在番茄中尚未被表征。研究人员以拟南芥DA1蛋白序列为查询进行BLAST搜索，并结合系统发育分析，鉴定出Solyc04g079840为可能的番茄DA1直系同源基因，命名为SlDA1。研究人员构建了TRV-TnpB-gRNA^SlDA1-mSlFT载体，采用相同方法感染包括M82、Ailsa Craig和Sweet 100等多个番茄栽培种，以测试该系统在不同栽培种中的有效性。M82的27株注射植物中约五周后产生了41个新生枝条，随机收集每个新生枝条的三片叶片进行基因组DNA提取，PCR扩增靶区域后进行Sanger测序。41个新生枝条中，#3、#23、#32和#38四个感染枝条在SlDA1靶位点附近观察到混合测序峰，提示存在突变。进一步扩增子测序分析显示这四个枝条中SlDA1基因的indel频率为64.36%至99.68%。值得注意的是，#3和#23枝条包含超过99%的编辑读数，由约50%的一种缺失类型和约50%的另一种组成，提示这些枝条为双等位基因突变体，两个同源染色体上的两种不同突变在枝条发育极早期即已产生。Ailsa Craig和Sweet 100中也观察到相似的编辑结果。Ailsa Craig的47个新生枝条中鉴定出四个编辑枝条，indel频率为35.76%至89.62%；Sweet 100的24个枝条中两个编辑枝条的编辑效率分别为84.03%和99.42%。为评估编辑等位基因是否可遗传，研究人员首先筛选了M82背景中TRV-TnpB-gRNA^SlDA1-mSlFT #3、#23、#32和#38植株的子代。每个品系48粒种子萌发后，由于子代幼苗无可见表型，通过Sanger测序检测靶向突变的存在。#3和#23植株的所有子代均携带双等位基因或纯合突变；#32品系子代中38%为纯合突变、44%为双等位基因突变；#38品系子代中42%为纯合突变、38%为双等位基因突变。Ailsa Craig和Sweet 100编辑植株的子代同样携带高比例的可遗传SlDA1突变。此外，RT-PCR分析表明任何子代幼苗中均未检测到TRV2衣壳蛋白RNA或TnpB转录本，提示子代为无病毒状态。PCR分析进一步证实不存在病毒载体序列，表明子代不含T-DNA插入。这些结果证明TRV-TnpB-gRNA-mSlFT介导的无转基因可遗传编辑可应用于农艺重要性状相关基因，且适用于多种不同的番茄栽培种。

**SlDA1功能缺失导致果实增大表型。** 为探究SlDA1突变的表型效应，研究人员选择了携带不同移码突变的三株纯合突变系进行分析。所有三株独立的SlDA1突变系均表现出明显增大的果实，定量测量进一步证实了这一观察。突变体的果实高度和果实直径均显著增加，果实鲜重相比野生型增加了22%至30%。花朵也呈现明显增大。这些结果表明SlDA1的破坏促进了番茄的器官生长，导致果实增大，与DA1同源基因在调控植物器官大小中的保守功能一致。

在讨论部分，研究人员指出为现代作物基因组编辑发展快速便捷的策略以消除稳定转基因整合的需求、减少监管障碍至关重要。病毒诱导的基因组编辑（VIGE）已成为实现这些目标的有前景的方法。近期多项研究利用TRV向表达Cas9的转基因番茄递送gRNA实现了无需组织培养的可遗传基因编辑，但该方法仍需通过组织培养和植物转化产生Cas9表达植株，且在获得编辑后需自交或回交去除转基因组分。本研究中，TRV介导的TnpB及其gRNA递送在番茄新生枝条中高效产生了SlPDS和SlDA1基因的靶向突变，并稳定传递至子代，同时克服了番茄基因组编辑依赖组织培养和转基因组分的两大障碍。研究人员靶向了易于观察表型的SlPDS标记基因以及此前未被表征的SlDA1基因，证明其破坏可增加果实大小，并在四个番茄栽培种中验证了该方法的稳健性，表明该系统可用于基因功能分析和作物改良，且可能适用于广泛的番茄栽培种。此外，通过敲除SlDA1获得果实增大的植株，也为提高产量的番茄改良提供了宝贵的遗传资源。

研究人员分析了该系统的设计考量与优化方向。FT基移动RNA元件曾被提议用于增强基因组编辑试剂向顶端分生组织的长距离运输。然而，当番茄幼苗通过子叶注射接种TRV-TnpB-gRNA^SlPDS-mSlFT载体时，仅观察到低水平的体细胞编辑且未获得编辑子代，这与前人在番茄和辣椒中的研究结果一致。该现象至少部分归因于植物抗病毒免疫反应的激活限制了病毒复制和系统移动，从而限制了病毒在顶端组织中的积累和持续存在。此外，即使少量病毒到达茎尖，紧凑型核酸酶TnpB相对适度的编辑效率也可能进一步制约生殖细胞的成功诱变。同时，TRV在复制和传播过程中可利用模板切换重组丢失TnpB和/或wRNA cargo序列，产生更小、复制更有效但无法进行基因组编辑的病毒颗粒。为克服这些限制，研究人员采用了基于新生枝条的编辑策略，使基因组编辑发生在新生枝条分生组织起始和形成前不久，绕取长距离病毒移动的需求，从而促进靶向突变的稳定遗传。与拟南芥中基于浸渍的接种方法相比，该策略较少依赖全株长距离病毒移动，因此可能更易适应较大植株和多样化作物物种。TRV载体具有超过400种植物物种的广泛寄主范围，提示所述方法应适用于许多其他作物。此外，ISYmu1尺寸紧凑，很可能被纳入装载容量与TRV相当的其他病毒载体，如马铃薯X病毒（PVX）和豌豆早褐病毒（PEBV），进一步扩展可能受益于该方法的作物范围。鉴于植物体内病毒感染策略已在许多不同病毒和植物物种中得到验证，可能利用ISYmu1的系统数量庞大。该方法尤其适用于难以遗传转化的顽固物种。未来进一步提高ISYmu1及相关TnpB酶的编辑效率和靶序列范围对于充分发挥该策略的潜力至关重要。

研究结论：通过整合紧凑型RNA引导核酸酶、病毒感染和新生枝条再生的优势，该工作展示了一种更快速、更简单、更具成本效益的可遗传基因组编辑方法，能够推进番茄及其他作物的功能基因组学和精准育种。