《Chinese Medical Journal》：Therapeutic siRNA: Mechanisms, challenges, strategies, and clinical translation
核糖核酸干扰(RNAi)是一种古老的生物防御机制，用于抵御外部入侵。从机制上讲，小干扰核糖核酸(siRNA)可根据碱基互补配对原则特异性结合任何靶基因，从而发挥沉默效应。因此，siRNA具有作为多种疾病高效治疗药物的潜力。然而，由于其易被核酸酶降解、脱靶效应以及细胞摄取率低等问题，基于siRNA的药物开发仍面临挑战。幸运的是，随着化学修饰和递送系统的进步，首个siRNA治疗药物patisiran于2018年获美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变(hATTR)，这标志着siRNA研究领域的一个重要里程碑。随后，又有七种siRNA药物上市。因此，siRNA药物正逐步成为标准药物治疗工具。本综述介绍了siRNA的作用机制、递送屏障、化学修饰和递送平台，并总结了已商业化的siRNA药物及部分临床试验，从而提供了关于siRNA药物修饰、递送策略、作用机制及最新临床试验的全面知识图谱。
**引言**
siRNA技术重塑了分子医学领域，已成为基因沉默的显著工具。从生物学现象到临床应用的进程表明，siRNA具有治疗多种疾病的潜力。追溯至20世纪90年代末，Fire和Mello在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中揭示了RNA干扰(RNAi)通路。这一发现开辟了分子生物学的新途径，凸显了细胞通过RNA引导机制调控基因表达的自然方式。RNAi由长片段双链RNA(dsRNA)触发，经Dicer酶切割为21-23个核苷酸长的siRNA片段。siRNA的作用机制根植于其引导RNA诱导沉默复合体(RISC)靶向并降解互补的信使RNA(mRNA)，从而阻止特定基因的翻译。此外，由于人类基因组知识的广泛积累，任何蛋白质编码基因均可通过siRNA降解。因此，siRNA是沉默与多种疾病相关基因的有力工具。
尽管具有治疗潜力，siRNA从实验室工具到药物的转化之路充满挑战。关键障碍包括siRNA在生理环境中的不稳定性、脱靶效应以及向靶细胞的低递送效率。生物流体中的不稳定性、快速清除以及难以穿越细胞膜限制了未修饰siRNA的治疗应用。此外，siRNA与脱靶基因的意外相互作用可能导致不良副作用和毒性风险。
应对这些挑战需要开发精密策略。siRNA分子的化学修饰，如2'-O-甲基化(2'-OMe)和硫代磷酸酯(PS)键的引入，已被用于增强其稳定性并减少脱靶效应。此外，递送系统的演进，包括脂质纳米粒(LNPs)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)和聚合物基载体，对于促进siRNA向细胞的高效靶向递送至关重要。这些努力的成果体现在成功通过临床试验并上市的siRNA药物中。Patisiran作为靶向转甲状腺素蛋白(TTR)治疗遗传性TTR淀粉样变(hATTR)的标志性siRNA治疗药物， exemplifies siRNA的成功临床应用。截至目前，已有八种siRNA药物获批用于临床应用， demonstrating siRNA-based therapies在治疗多种疾病方面的潜力。
**siRNA药物的历史与发展**
siRNA的发展标志着分子生物学和遗传学的关键篇章。1998年，Fire和Mello鉴定了dsRNA在线虫(C. elegans)中参与转录后基因沉默(PTGS)的机制，即RNAi。随后，Wianny和Zernicka-Goetz将dsRNA递送至小鼠体内，成功抑制了特定蛋白的表达。2001年，Elbashir等发现21-22个核苷酸长的dsRNA可在哺乳动物细胞中诱导RNAi沉默而不触发非特异性干扰素反应。这一发现使siRNA迅速成为生物学研究的常用工具。
然而，最初使用未修饰siRNA的临床试验导致了免疫相关毒性和不确定的RNAi效应。为解决这些问题，研究人员开发了LNPs作为siRNA的递送系统。这些纳米粒(NPs)保护siRNA免受核酸酶降解并提高其递送效率。除LNPs外，新的siRNA递送系统显著改善了其应用潜力。此外，对siRNA的额外化学修饰可提高其基因沉默效力并降低免疫原性。
随着这些进展，siRNA治疗近年来显著进步。新一代基于脂质的纳米粒和其他递送系统在临床试验中显示出改善的安全性和有效性，导致多种siRNA药物获批用于治疗包括罕见遗传病、心血管疾病和其他慢性疾病在内的多种疾病。
**siRNA的作用机制**
siRNA由较长的dsRNA或哺乳动物细胞中的短发夹RNA(shRNA)生成。属于RNase III家族的Dicer酶识别并切割dsRNA分子为长约21-25个碱基对的siRNA双链体，其3'端带有二核苷酸突出，5'端以单磷酸基团终止。siRNA双链体中的一条链，即正义链(sense strand)，与靶mRNA片段序列相同；另一条链即反义链(antisense strand)，与靶mRNA互补。siRNA双链体随后与人免疫缺陷病毒反式激活应答RNA结合蛋白(TRBP)和Argonaute蛋白2(AGO2)结合形成RISC。正义链仅作为乘客链随后从复合体中释放；反义链保留下来，作为引导链带领并校准复合体与靶mRNA序列对齐。此后，RISC中的AGO2切割靶序列，从而沉默基因表达。
研究人员发现siRNA来源于昆虫和哺乳动物的基因组，但大多数已表征的siRNA或由病毒编码，或经实验诱导。因此，在果蝇、小鼠和人类等生物的细胞中，经典RNAi通路主要用于抵御外部威胁。与此一致，缺乏基于siRNA沉默通路关键蛋白组分的果蝇突变体可存活、可育，但极易感染病毒。治疗性siRNA通过绕过产生成熟siRNA的初始Dicer介导步骤而发挥作用。
从机制上讲，siRNA可被设计为特异性靶向任何基因，从而为突变、过表达基因或其他遗传缺陷引起的疾病开发新的治疗策略。通过沉默特定基因，siRNA可有效阻断致病蛋白的表达或恢复正常蛋白表达水平，为治疗以往难以处理的疾病提供了工具。
**siRNA药物的挑战**
**体内不稳定性**
作为核酸的一种，siRNA在体内易被核酸酶降解。血清中存在多种酶，裸siRNA的半衰期<10分钟。因此，研究人员开发了递送系统以保护siRNA免受降解。然而，纳米载体包裹的药物常吸附于血清蛋白。虽然某些载体可通过循环递送siRNA，内化后的内体 trapping是另一限制因素。当通过内吞作用进入细胞时，siRNA通常被包裹在内体中并最终运输至溶酶体。溶酶体是含有多种水解酶的细胞器，主要降解和回收细胞内的废物大分子。如果siRNA被trap在溶酶体中随后被降解，则无法到达细胞质与靶mRNA结合发挥其基因沉默效应。据先前报道，仅约1%的siRNA能成功逃离内体。即使逃逸至细胞质，siRNA仍可能被细胞内RNA酶降解，使其难以高效结合TRBP和AGO2。
**免疫原性与脱靶效应**
如前所述，siRNA倾向于通过Toll样受体(TLRs)和其他细胞质传感器激活先天免疫效应并诱导脱靶效应。TLRs存在于肺、真皮、主动脉以及脉络膜和脐静脉中。siRNA可结合TLR3的胞外结构域诱导受体二聚体形成。大多数细胞内通路由TLR7/8和TLR3传感器的激活所诱导。TLR7/8通过髓样分化初级反应-88通路转导信号，导致肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素12(IL-12)的分泌。TLR3还通过含Toll/IL-1受体结构域的接头蛋白转导信号，在细胞质中诱导干扰素-β(IFN-β)蛋白，促进TNF-α和IFN-β的产生。
此外，siRNA通过TLR非依赖性通路诱导先天免疫反应，如蛋白激酶R或维甲酸诱导基因-1(RIG-1)蛋白的结合。RIG-1在其N端附近含有两个caspase募集结构域，可向下游通路发出信号，触发IFN-β和炎症介质的产生。TLR和非TLR感测通路的刺激在很大程度上取决于siRNA序列。富含AU的寡核糖核苷酸(ORNs)介导人TLR8激活，而富含GU的ORNs介导TLR7/8激活。
除免疫原性外，脱靶沉默与其他因素相关。较短的siRNA可能更易发生非特异性结合，但19-25个核苷酸范围内的siRNA显示出相似的基因沉默效率。RISC介导的RNAi可容忍与mRNA的错配核苷酸，使得反义链与mRNA互补核苷酸<7个的siRNA可抑制非靶向基因。一些研究还表明，反义链的核苷酸位置2-7或2-8（种子区域）与3'非翻译区(UTR)之间的完全互补性是必要的。此外，Nielsen报道，位置1存在腺嘌呤(A)以及位置9存在腺嘌呤或尿啶(U)可增强脱靶效应。
此外，AGO2可选择正义配体发挥基因沉默功能。反义链5'端富含A/U碱基和正义链5'端富含鸟嘌呤(G)/胞嘧啶(C)碱基可有效降低正义链被整合入RISC的风险，减轻相关脱靶效应。Schwarz等也报道，5'端与另一链结合较弱的siRNA链更容易整合入RISC。过量的siRNA也可能影响微小RNA(miRNA)功能，因为细胞对外源性siRNA组装RISC的能力有限。先前研究表明，阻断细胞短发夹/miRNA(sh/miRNA)通路可导致小鼠剂量依赖性肝毒性和致死效应。另一项研究在使用人工miRNA时显示了阳性结果，提示shRNA过表达可损害miRNA加工。此外，siRNA不良的药代动力学性质及其递送方法等因素也可导致脱靶效应。
**递送障碍**
除上述挑战外，siRNA的递送过程，包括组织穿透、细胞进入和肾脏清除，充满挑战。通常，由于毛细血管内皮具有丰富的黏附和紧密连接，直径>5 nm的分子无法穿越，因此停留在循环中直至被清除。siRNA可能被动积聚于肝脏、脾脏和某些肿瘤，因为这些组织允许直径达200 nm的较大分子进入。此外，血流和组织细胞外基质中的巨噬细胞和单核细胞可清除外来物质，从而激活不良的免疫反应。
为发挥基因沉默效应，siRNA必须被靶细胞内化。然而，siRNA具有亲水性，不易穿越细胞膜。此外，当siRNA在细胞外基质中长时间停留时，其被巨噬细胞和单核细胞捕获的可能性增加。此外，直径<10 nm的分子易被肾脏过滤，半衰期较短，导致效率低下。
**克服挑战的策略**
尽管存在与siRNA稳定性、递送和脱靶效应相关的挑战，已开发出多种策略来提高基于siRNA的治疗药物的效率和特异性。
**化学修饰**
siRNA的化学修饰可在一定程度上提高其效率、特异性和稳定性，并降低其毒性和免疫原性。具体而言，化学修饰倾向于放置在siRNA的磷酸骨架、核糖部分或碱基上。
磷酸骨架修饰是增加siRNA成药性常用的方法。硫代磷酸酯(PS)和硫代磷酸二酯(PS
2)取代应用广泛。PS取代通过将磷酸二酯的非桥氧替换为硫原子实现，可抵抗体内核酸酶的活性，并更易与血浆蛋白（尤其是白蛋白）结合，从而显著增加循环时间。蛋白结合有利于寡核苷酸进入细胞。然而，蛋白结合通常与体内毒性呈正相关。因此，部分PS修饰的siRNA分子在保留疗效的同时表现出改善的药代动力学。除patisiran外，目前其他药物在链末端引入六个PS键。
核糖修饰已研究多年。由于RNase需要2'端羟基水解RNA，2'-核糖修饰已被广泛用于保护siRNA免受RNase攻击。2'-O-甲基(2'-OMe)是一种天然存在的核糖，常用于药物开发。类似地，2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)是2'-OMe最广泛使用的类似物之一，2'-氟(2'-F)也可用于siRNA核糖修饰。此外，这些修饰可降低免疫原性。然而，如果PS键过度使用，任何单一2'-修饰的广泛使用都可能降低基因沉默效应。
此外，2'-C、2'-O、3'-C和4'-C糖环也可发生修饰，产生包括非锁核酸(UNA)和锁核酸(LNA)在内的分子。UNA可通过向双链siRNA引入化学不对称性来防止乘客链整合入RISC。LNA可将核糖"锁定"在其首选的C3'-内型构象中，显著增加与mRNA的结合亲和力。
碱基取代有利于siRNA药物的开发。2-硫代尿苷可提高热力学稳定性和核酸酶抗性；2'-脱氧尿苷可减少I型干扰素分泌；2,4-二氟甲苯可增强正义链中央区域的不稳定性和基因沉默效应。然而，将人工碱基掺入基因组仍引起许多研究人员的谨慎关注。
**递送系统**
递送系统分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括腺相关病毒、慢病毒、辅助依赖型腺病毒和单纯疱疹病毒1型载体。非病毒载体包括仿生系统（如LNPs、蛋白纳米粒、GalNAc和细胞膜包被纳米粒）、聚合物基系统以及无机基系统（如金、介孔二氧化硅和磁性氧化铁纳米粒，以及碳纳米管、量子点、黑磷和金属有机框架）。病毒载体因高免疫原性和低容量而应用受限，而非病毒载体因低免疫原性、低生产成本、良好生物相容性和相对较高的安全性而被广泛应用。
**LNPs**
LNPs已成为siRNA递送的主要平台。LNPs可与血液中的载脂蛋白E(apoE)结合，也可被肝脏内皮网状系统吞噬。由于癌症部位的血管渗漏，LNPs也可在肿瘤中积聚。第一代LNPs包括脂质体，脂质体是由脂质双分子层组成的球形囊泡。这些双分子层通常由磷脂组成，磷脂是两亲性分子，同时具有亲水性和疏水性。这种独特结构使脂质体能够包裹亲水性和亲脂性物质。胆固醇常被添加以稳定脂质体结构并延长血液循环时间。此外，脂质体可经聚乙二醇(PEG)修饰以逃避免疫系统并增强循环时间。
阳离子LNPs是用于核酸药物递送最广泛的脂质基递送系统。阳离子LNP制剂包含四种脂质：可电离阳离子脂质、辅助脂质(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、胆固醇和PEG-脂质偶联物。可电离阳离子脂质是最重要的辅料，在递送和转染效率中起决定性作用。中性辅助脂质为饱和磷脂，可增强阳离子脂质体的相转变温度，支持层状脂质双分子层结构的形成并稳定其排列。胆固醇因其强膜融合特性而促进细胞摄取。表面的PEG化脂质可改善亲水性并增加颗粒聚集情况下的稳定性以及被免疫系统快速清除的问题。
**GalNAc**
GalNAc是半乳糖的一种糖衍生物，与肝细胞表面高表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR，约每细胞500,000个)具有高结合亲和力。与ASGPR结合后，GalNAc通过内吞作用进入细胞形成内体，此后通过尚未完全了解的机制从内体中逃逸，从而将足量siRNA递送至细胞质并沉默靶mRNA。目前，GalNAc作为递送系统广泛应用于肝脏。
**聚合物**
聚合物基系统因其生物相容性、保护siRNA免受降解的能力以及递送效率，已成为siRNA递送的关键。这些系统通常涉及聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)以及生物聚合物。PLGA可生物降解，提供siRNA的控制释放并降低全身毒性。PEI的正电荷可与siRNA形成稳定复合物并增强其细胞摄取。
**siRNA药物的临床应用**
目前已有多款siRNA药物获批，均与肝脏异常基因表达相关。
**Patisiran**
Patisiran由Alnylam Pharma开发，于2018年获FDA批准，是首个获批的siRNA治疗药物。Patisiran用于治疗hATTR，这是一种罕见的遗传性疾病，特征是异常淀粉样蛋白的积累导致进行性神经损伤和心肌病。该药物包裹在LNPs中，这种先进的递送系统可与apoE结合并被肝脏内皮网状系统吞噬。Patisiran通过沉默肝细胞细胞质中的TTR发挥作用，从而减少TTR蛋白的产生，这是hATTR发病机制的基础。
在APOLLO试验中，接受patisiran治疗的hATTR患者在神经病变症状和生活质量方面显著改善。试验显示，18个月内改良神经病变损害评分(mNIS+7)平均降低6分，而安慰剂组平均增加28分。开放标签扩展研究也表明，patisiran有助于快速降低TTR并改善hATTR和多发性神经病变患者肝移植后的神经病变、生活质量和自主神经症状。
**Givosiran**
Givosiran于2019年获FDA批准用于治疗急性间歇性卟啉症(AIP)。其通过特异性降解血红素生物合成途径中的氨基乙酰丙酸合酶1(ALAS1) mRNA，从而减少有害卟啉的积累。Givosiran经16个2'-F取代和28个2'-OMe取代核苷酸修饰，链末端分布六个PS键，并通过GalNAc递送，实现肝脏的高摄取。在ENVISION关键III期临床试验中，givosiran治疗6个月使卟啉病发作次数减少74%，同时改善了生活质量指标并减少了血红素的使用。
**Lumasiran**
Lumasiran由Alnylam Pharma设计用于治疗原发性高草酸尿症I型(PH1)，于2020年获FDA批准。其靶向并沉默羟基酸氧化酶1(HAO1) mRNA，减少草酸盐产生，从而降低PH1患者肾脏损伤和全身性草酸沉着症的风险。Lumasiran同样使用GalNAc偶联递送系统，经10个2'-F和34个2'-OMe取代以及六个PS链端修饰。在双盲III期试验中，lumasiran组24小时尿草酸盐排泄量和血浆草酸盐水平的降幅显著优于安慰剂组。
**Inclisiran**
Inclisiran由Novartis开发，于2021年获FDA批准，是心血管医学的重大突破。其选择性沉默前蛋白转化酶枯草溶菌素/毕赤酵母蛋白酶9型(PCSK9) mRNA，有效降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。Inclisiran经一个2'-MOE、11个2'-F和三个2'-OMe取代修饰，包括六个PS链端修饰，并与GalNAc偶联以实现肝细胞高摄取。其推荐剂量为初始皮下注射300 mg，三个月后第二剂，此后每六个月一次，这种给药方案减少了给药频率。
**Vutrisiran**
Vutrisiran（也称AMVUTTRA）是另一种靶向TTR治疗hATTR的siRNA药物，于2022年获FDA批准。其基于Alnylam Pharma的增强稳定化学和第三代GalNAc-siRNA递送平台，包含35个2'-OMe取代、9个2'-F取代和六个PS链端键。推荐剂量为25 mg皮下注射，每三个月一次。III期随机对照试验表明，vutrisiran在9个月时达到mNIS+7变化的主要终点，疗效不劣于patisiran。
**Nedosiran**
Nedosiran由Novo Nordisk开发，抑制肝脏乳酸脱氢酶(LDH)表达，该酶是过量草酸盐产生的关键催化酶，于2023年获FDA批准用于治疗PH1。其具有19个2'-F取代、35个2'-OMe取代和六个PS键，与GalNAc偶联后在皮下给药后实现高肝脏摄取。在PHYOX2安慰剂对照临床试验中，接受nedosiran治疗的患者在第90天至180天期间24小时尿草酸盐排泄量显著降低。
**Fitusiran**
Fitusiran是首个获批用于治疗血友病的siRNA药物，于2025年获批。其通过靶向抗凝血酶(AT) mRNA调节血友病患者的凝血-抗凝平衡，皮下注射每年至少六次。III期多中心随机开放标签研究表明，fitusiran预防治疗组的年化出血率显著低于按需使用旁路制剂组，降幅达90.8%。
**Plozasiran**
Plozasiran由Arrowhead Pharmaceuticals开发，于2025年获FDA批准。该药物靶向载脂蛋白C-III(apoC-III)，作为饮食辅助治疗降低家族性高乳糜微粒血症综合征成年患者的甘油三酯水平。其含有共价连接的三个GalNAc残基配体以促进向肝细胞的递送，核糖亚基的2'位经氟(2'-F)或甲氧基(2'-O-Me)修饰，每条链还包含多个PS键。III期随机安慰剂对照双盲试验显示，从基线到第10个月，25 mg plozasiran组空腹甘油三酯水平中位变化为-80%。
**肝外靶向siRNA药物的临床试验**
目前，所有获批的siRNA药物均靶向在肝细胞细胞质中高表达的mRNA，如PCSK9、TTR和LDH。理论上，siRNA可特异性结合任何类型的mRNA。然而，由于递送困难，极少有产业赞助的临床试验专注于肝外疾病，包括肿瘤、阿尔茨海默病、增生性瘢痕和眼部疾病。
**OLX-10010**
OLX-10010由OLiX Pharmaceuticals开发，通过降低结缔组织生长因子(CTGF)表达治疗增生性瘢痕，目前处于II期临床试验阶段。其通过胆固醇偶联促进细胞膜穿透，旨在提高局部给药效率。已完成临床试验数据表明，每两周皮内注射OLX-10010可显著改善增生性瘢痕外观。
**Mivelsiran**
Mivelsiran由Alnylam Pharmaceuticals开发，用于治疗阿尔茨海默病。该siRNA药物靶向淀粉样前体蛋白(APP)，其缺失加速Aβ寡聚化。siRNA与细胞穿透组分(C16)偶联，设计用于每六个月鞘内给药一次。I期研究结果展示了其良好的耐受性和显著的Aβ降低效果，II期临床试验目前正在进行中。
**结论与展望**
本综述对siRNA的探索强调了其在基因治疗中的变革潜力。然而，由于公司未披露某些数据，部分siRNA药物的讨论点存在不足，特别是关于其毒性研究。由于这些药物近期获批上市，其安全性和长期疗效需要进一步研究。具体临床应用的实例仍然缺乏，且siRNA技术正在快速发展，本文讨论的一些技术可能很快会被更新或替代。
转录后基因沉默(PTGS)是siRNA的核心作用机制，已成为理解和操纵基因表达的重要指引。虽然siRNA技术可在体外敲低靶基因，但由于稳定性、脱靶效应、免疫原性和递送困难等问题，其在临床应用中仍面临挑战。多年来，化学修饰技术如2'-OMe和2'-F取代以及PS键的进步增强了siRNA的稳定性和基因沉默效应。与此同时，LNPs和GalNAc等精密递送系统的发展提高了siRNA递送效率，标志着其临床应用的关键一步。这些努力的成果体现在八种获批siRNA药物的商业化成功中。
siRNA药物提供了一种新的治疗方法，尤其在传统治疗无效时。例如，他汀类药物是动脉粥样硬化性心血管疾病患者的一线用药；若无效，可使用inclisiran作为替代。未来研究应聚焦于改进递送系统以提高疗效并减少脱靶效应，扩展至非肝脏器官的治疗应用，并探索与其他疗法（如免疫治疗）的联合应用。新型纳米技术的发展可实现更精确高效的结果，而临床前研究已展示了针对成纤维细胞、缺血性卒中等的新型递送策略。总之，siRNA技术通过沉默特定基因，在基因治疗中展现出巨大前景，其获批药物 exemplify了治疗以往难以处理疾病的潜力。
