BBX5通过激活PIF4及生长素(auxin)生物合成与信号基因促进拟南芥避荫反应(Shade Avoidance)

《PLOS Genetics》：Promotion of shade avoidance by BBX5 involves activation of PIF4 along with auxin biosynthetic and signaling genes

　　

邻近植株触发光质变化，调控植物的多种发育与生理过程。phyB(光敏色素B)—PIF4(PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4)模块是植物感知并响应避荫信号的核心调控枢纽。本研究发现B-box结构域蛋白5(BBX5)是避荫反应的正向调节因子。phyB与BBX5互作并促进其蛋白稳定性；相反，E3泛素连接酶COP1(CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1)与BBX5结合并通过26S蛋白酶体途径使其降解。避荫处理早期，BBX5结合PIF4启动子上调其转录；同时BBX5直接结合生长素(auxin)生物合成基因YUCCA8(YUC8)及生长素信号基因INDOLE-3-ACETIC ACID INDUCIBLE 19(IAA19)的启动子，激活其在遮荫条件下的表达。研究表明，BBX5作为PIF4、YUC8和IAA19的转录激活因子，促进植物响应遮荫信号下的生长发育。

本文发表于《PLOS Genetics》，报道了拟南芥Arabidopsis thaliana中B-box蛋白BBX5(B-box PROTEIN 5)作为phyB—PIF4模块上游的新组分，通过直接激活PIF4及生长素(auxin)通路基因YUC8和IAA19，正向调控低红/远红光比(low R/FR)诱导的避荫反应(Shade Avoidance Syndrome, SAS)。此前已知phyB感知低R/FR后解除对PIF4的抑制，PIF4激活生长素基因促进下胚轴伸长，而BBX家族成员在SAS中的作用尚不完全清楚，特别是BBX5是否参与SAS调控未见报道。本研究通过CRISPR-Cas9敲除、过表达、蛋白互作、转录调控及转录组分析，阐明phyB稳定BBX5而COP1介导其降解，BBX5在避荫早期结合并激活PIF4、YUC8和IAA19启动子，揭示BBX5—PIF4—YUC8/IAA19级联信号通路促进SAS的分子机制，完善了对植物光—激素互作调控株型建成的认识。

主要关键技术方法

以拟南芥Col-0为背景，利用CRISPR-Cas9构建bbx5-1和bbx5-2缺失突变体，利用原生启动子驱动BBX5-GFP及35Spro:BBX5-Flag构建过表达及转基因株系；通过荧光素酶互补成像(LCI)和Co-IP检测phyB、COP1与BBX5的体内外互作；用CHX(放线酮)脉冲追踪及蛋白酶体抑制剂MG132分析蛋白稳定性；通过RT-qPCR和双荧光素酶报告系统(Dual-LUC)检测PIF4、YUC8、IAA19转录响应；凝胶迁移实验(EMSA)和ChIP-qPCR验证BBX5对靶基因启动子的直接结合；对白光及避荫处理1 h的Col-0与bbx5-1进行RNA-seq差异表达及GO富集分析；通过遗传杂交获得bbx5 phyB、bbx5 cop1-6、bbx5 pif4-2等多重突变体，测定白光与低R/FR下的下胚轴及叶柄表型。

研究结果

BBX5 promotes shade-induced hypocotyl and petiole elongation（BBX5促进低R/FR诱导的下胚轴和叶柄伸长）

bbx5突变体在低R/FR下下胚轴和叶柄较野生型显著变短，BBX5过表达株系则变长；白光下各基因型无显著差异。表明BBX5是避荫诱导下胚轴与叶柄伸长的正向调节因子。BBX5转录水平在低R/FR短时略有波动后下降，蛋白水平在避荫早期降低而后重新积累。

Shade disrupts the interaction between phyB and BBX5（遮荫破坏phyB与BBX5的互作）

LCI和Co-IP证实phyB与BBX5互作，且该互作依赖phyB的活性Pfr形式，低R/FR处理后二者解离。phyB缺失(phyB-9)背景下BBX5蛋白丰度降低且CHX追踪下降更快，MG132可阻滞降解，说明phyB通过抑制26S蛋白酶体依赖降解来稳定BBX5。遗传上bbx5 phyB-9下胚轴略短于phyB-9，表明二者在SAS中相互依存。

COP1 interacts with and de-stabilizes BBX5（COP1与BBX5互作并促进其降解）

Y2H分段截短显示COP1结合BBX5中间区段含Valine-Proline(VP)基序，VP→AA突变消除互作。LCI和Co-IP在体内证实COP1—BBX5互作。cop1-6背景下BBX5蛋白积累增加且CHX处理下降减缓，MG132抑制低R/FR下的BBX5降解，证明COP1通过26S蛋白酶体促BBX5降解；低R/FR早期BBX5减少与COP1核转位增强一致。

BBX5 upregulates the expression of PIF4 during the early phase of shade exposure（BBX5在避荫早期上调PIF4表达）

低R/FR处理1–6 h，bbx5-1中PIF4转录及蛋白水平低于野生型，过表达株系升高，12 h后差异消失。双荧光素酶报告及ChIP-qPCR显示BBX5结合PIF4启动子P2区(低R/FR下还结合P3区)并激活其转录。bbx5 pif4-2双突变体避荫下胚轴短于单突变体，说明BBX5部分通过PIF4发挥作用但还有PIF4非依赖途径。

BBX5 binds to the promoters of YUC8 and IAA19 and activates their transcription under low R/FR conditions（BBX5结合YUC8和IAA19启动子并在低R/FR下激活其转录）

RNA-seq显示bbx5-1中110个避荫响应基因下调，GO富集到生长素(auxin)响应条目，含YUC8(生长素生物合成)和IAA19(auxin信号)。RT-qPCR、双荧光素酶报告证实BBX5激活二者；EMSA显示重组BBX5直接结合含G-box(YUC8)或GT1/YUC8含G-box(IAA19)的启动子片段；ChIP-qPCR证实体内富集于YUC8和IAA19启动子。bbx5 pif4-2中YUC8/IAA19表达与pif4-2相近且低于野生型，说明BBX5与PIF4共同或部分独立调控这些auxin基因。

讨论与结论翻译

低R/FR使phyB由活性Pfr转为Pr并移出细胞核，解除对PIF4的抑制并使PIF4积累；本研究进一步发现phyB与BBX5互作并稳定BBX5，而E3连接酶COP1结合BBX5中间VP基序通过26S蛋白酶体促其降解，二者拮抗调控BBX5蛋白丰度。避荫早期残存phyB仍稳定少量BBX5，BBX5结合PIF4启动子上调其转录使PIF4提前积累；同时BBX5直接结合YUC8和IAA19启动子激活其表达。因此BBX5通过激活PIF4(间接放大auxin通路)及直接激活YUC8/IAA19(生长素生物合成与信号)，促进auxin介导的避荫生长。研究提出的工作模型为：遮荫条件下，phyB稳定BBX5而COP1促BBX5降解；BBX5直接靶向PIF4、YUC8和IAA19激活其表达，从而促进拟南芥避荫反应。本研究揭示了BBX5—PIF4—YUC8/IAA19信号级联在植物避荫响应中的分子框架。