通过电穿孔技术在牛的ALB基因位点中特异性地将人类编码序列导入胚胎

《BMC Biotechnology》：Electroporation-mediated site-specific knock-in of a human coding sequence into the bovine ALB locus in embryos

　　

摘要

背景

将基因编辑工具高效地传递到胚胎中对于生产基因编辑牛至关重要。体细胞核移植和显微注射是常用的技术，但电穿孔技术因其技术简单性、高通量处理能力和适用于大规模应用而最近受到了关注。然而，由于透明带的存在以及可传递材料的尺寸限制，其应用主要局限于基因敲除。为了解决这些挑战，在本研究中，我们使用单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）和腺相关病毒（AAV）载体作为供体，优化了在牛胚胎中的电穿孔介导的基因敲入（KI）策略。

结果

使用具有不对称同源臂（左侧10 bp，右侧25 bp）的ssODN供体进行的初步实验中，基因敲入（KI）囊胚（BL）的发生率为13.9±14.1%，尽管不同重复实验的结果差异较大。相比之下，携带61 bp目标序列且两侧有500 bp同源臂的AAV供体在优化AAV浓度和同源臂长度后，能够实现一致的基因敲入效果。利用优化后的系统，成功将2.2 kb的人类白蛋白编码序列插入到牛的白蛋白基因位点，基因敲入囊胚的发生率为55.6±41.6%。

结论

总体而言，这些发现表明，电穿孔结合AAV介导的供体传递是一种生成转基因牛胚胎的有效策略，这是迈向将转基因牛作为高价值蛋白质生产生物反应器的重要第一步。