综述：在西班牙北部，人们会接触到来自蕨类植物的致癌化合物；对此进行了一项多学科的评估

《Environmental Research》：Environmental exposure to bracken-derived carcinogenic compounds: a multidisciplinary assessment in northern Spain

　　伊莎贝尔·费托（Isabel Feito）| 亚历克西斯·E·佩尼亚（Alexis E. Pe?a）| L·玛丽亚·塞拉（L. María Sierra）| 贾塞·曼努埃尔·阿尔瓦雷斯（José Manuel Alvarez）| 马·卢西亚·罗德里格斯（Ma Lucía Rodríguez）| 伯纳多·巴雷多（Bernardo Barredo）| 伊万·伊格莱西亚斯（Iván Iglesias）| 安娜·贝拉兹克斯（Ana Velázquez）| 安德烈亚·巴托洛梅（Andrea Bartolomé）| 丹尼尔·迪亚兹（Daniel Díaz）| 鲁思·K·埃尔南德斯（Ruth K. Hernández）| 胡安·马哈达（Juan Majada）| 埃莱娜·坎加（Elena Canga）| 海伦娜·费尔南德斯（Helena Fernández）

地区农业食品研究与发展服务局（SERIDA），西班牙阿斯图里亚斯省33630

**摘要**

蕨类植物（Pteridium aquilinum）在全球范围内广泛分布，其产生的致癌性illusane糖苷（IGs）引发了人们对以牲畜为主的生态系统中环境暴露的担忧。然而，这些化合物在自然水系统中的存在、迁移性和生物效应仍缺乏充分研究。本文通过对西班牙北部地区IGs的分布及其基因毒性进行了多学科评估，结合了植物组织和环境水样的化学分析以及体内和体外生物测定。从蕨类植物生长区域采集的茎叶样本和水样中检测了ptaquiloside（PTA）、ptesculentoside（PTE）及其降解产物（pterosins A和B）。所有植物样本以及大部分水样中均检测到了IGs及其衍生物，证明了这些化合物在环境中的传播和持久性。值得注意的是，在与牛死亡事件相关的地点，PTA的含量显著升高。通过SMART检测方法（在黑腹果蝇体内）和彗星试验（在人类细胞系中）评估了基因毒性，结果显示植物提取物以及浓缩水样均能诱导体细胞突变和DNA损伤。虽然植物中的基因毒性与其所含pterosin水平相关，但在水样中的关联较弱。这些发现揭示了蕨类植物、水污染和生物效应之间的重要环境暴露途径。IGs的广泛存在和生物活性突显了它们对生态系统和牲畜的潜在风险，强调了在以蕨类植物为主的地区进行环境监测的必要性。

**1. 引言**

Pteridium aquilinum（L.）Kuhn，又称蕨类植物，是分布最广的维管植物之一，除南极洲外遍布所有大陆（1）。它在pH值为5.5-7.5的土壤中生长最佳（1）。在温带和北方欧洲，其叶片春季生长，秋季枯萎；而在热带地区则可能全年存在（2）。其广泛的分布得益于高产孢子和无性繁殖能力，使其能够在适宜的栖息地中快速扩展（3）。蕨类植物通过密集且寿命长的叶片竞争其他植物资源，消耗土壤养分和水分（1）。尽管有报道指出其具有化感作用（4, 5），但这种作用并不一致（4, 5）。控制措施（如反复修剪或使用除草剂如Asulam）可以限制其扩散（6, 7）。

除了对生物多样性的影响外，蕨类植物还具有毒性。在高地和温带放牧区，它可能构成植被的主要组成部分。牲畜通常会避开蕨类植物，但在食物短缺时或意外情况下可能会摄入（1, 8, 9, 10, 11, 12）。常见的中毒症状包括马匹的硫胺素缺乏、绵羊和牛的急性出血性疾病、绵羊的失明、牛的流行性血尿以及牛上消化道的癌症（7, 13, 14）。

对于人类而言，接触蕨类植物会增加胃肠道癌症的发病率（15, 16, 17, 18）。接触途径包括直接食用、通过受污染的动物产品间接摄入、吸入孢子或接触受污染的土壤和水（19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36）。

蕨类植物的毒性来源于多种次生代谢物，包括二氢叶酸、苯甲酸、肉桂酸和对香豆酸、硫胺酶、氰化物、葡萄糖苷、braxins、黄酮类化合物、单宁、对羟基苯乙烯衍生物以及illusane糖苷（IGs）（13, 37, 38）。主要的IGs包括ptaquiloside（PTA）、caudatoside（CAU）、ptesculentoside（PTE）及其相关化合物如isoptaquiloside（IPTA）和ptaquiloside Z（PTA-Z）（14, 37, 38）。这些IGs可水解生成pterosins：PTA水解生成pterosin B，CAU生成pterosin A，PTE生成pterosin G（13, 14, 37, 39）。水解过程中产生的活性二烯酮中间体能够与DNA共价结合，形成烷基化加合物，从而导致动物出现致癌效应（9, 23, 37, 40, 41）。虽然长期以来PTA被认为是蕨类植物中的主要致癌物，但最近的研究表明，在北欧的P. aquilinum和澳大利亚的P. esculentum中，CAU和PTE的含量也相当高（42）。全球采样数据显示，PTA占Pteridium物种的约41%，CAU占37%，PTE占22%（42）。在P. aquilinum中PTA占主导地位，而在澳大利亚的P. esculentum中PTE占主导，占总illusane糖苷的40-73%（42）。

尽管蕨类植物具有生态和健康风险，但在西班牙（尤其是阿斯图里亚斯地区）对其的研究仍然有限（43, 44, 45）。最近有一项综合性的多学科研究评估了蕨类植物中的有毒化合物、水提取物的基因毒性、其对牛的危害及其在西班牙北部的分布（46）。该研究指出，牧民普遍认为所谓的“蕨类病”与P. aquilinum在放牧区的过度生长有关。然而，在发育阶段特异性分析、水系统中的存在及其相关生物效应方面仍存在重要空白，特别是在牲畜密度高的地区，这些效应可能被放大。

本研究旨在全面评估P. aquilinum及其在以蕨类植物为主的放牧区水样中的illusane糖苷（IGs）。具体而言，我们分析了不同季节采集的茎叶样本以及来自这些区域的水样，以检测ptaquiloside、ptesculentoside及其降解产物（pterosins A和B），并评估了蕨类植物水提取物的潜在生物效应，重点关注基因毒性。

我们假设P. aquilinum会在其组织中积累illusane糖苷，这些糖苷可能进入周围的水系统，并在那里保持生物活性并发挥基因毒性作用。通过结合化学和生物学方法，本研究旨在更好地理解蕨类植物衍生化合物的环境行为及其潜在的环境和毒理学意义。

**2. 材料与方法**

**2.1. 从Pteridium esculentum中提取illusane糖苷用于分析**

从澳大利亚生长的P. esculentum植物中分离并纯化了illusane糖苷ptaquiloside（PTA）、ptesculentoside（PTE）和caudatoside（CAU）（图S1）。所采用的方法（47）根据实验室条件进行了调整。具体操作如下：将10克冻干后的地上部分放入500毫升含有200毫升Milli-Q水的烧瓶中，用铝箔遮光，然后在室温下进行30分钟超声处理，随后在3500转/分钟和4°C下离心30分钟。上清液用Whatman 114滤膜过滤，所得提取物在-20°C下保存24小时。解冻后，再次在3500转/分钟和4°C下离心10分钟，然后过滤去除杂质。提取物通过HPLC-PAD（Waters 2695，检测器PAD 2996）进行检测，流速为1毫升/分钟，条件如下：进样体积25微升，温度20°C，流动相为MeOH:Milli-Q H2O（55:45），等度洗脱，运行时间25分钟，色谱柱为Kromasil 100-5 C18（5微米，25 × 0.46厘米），检测波长为220和264纳米。提取物分成两份，每份约100毫升，分别注入装有CC6聚酰胺树脂的色谱柱中，流速约为1毫升/分钟。随后在220和264纳米波长下进行HPLC-PAD分析。聚酰胺柱提取物通过SPE-HLB柱处理，柱子预先用12毫升Milli-Q水冲洗。每个柱子加入50毫升提取物，再用5毫升Milli-Q水冲洗，然后依次用5毫升40%甲醇水溶液洗脱。洗脱液在相同条件下进行HPLC-PAD分析。为了鉴定illusane糖苷，将部分聚酰胺柱提取物进行水解处理：1毫升溶液通过SPE-PA柱，加入70微升1 M NaOH，混合后在35°C水浴中涡旋孵育15分钟，再加入35微升冷却后的2.5 M三氟乙酸。样品在-20°C下保存，待进一步HPLC-PAD分析。使用PtrA（CAS 35910-16-8）和PtrB（CAS 34175-96-7）标准品鉴定pterosins。

**2.2. 在蕨类植物茎叶和水源中定量代谢物**

在阿斯图里亚斯多个地点采集的植物水提取物和水源样本中分析了PTA、PTE、PtrA和PtrB（见表1）。植物材料包括从阿斯图里亚斯三个地区采集的茎叶样本：Urbiés山脉（MU2）、Somiedo（BRV）和Picos de Europa（PEBEL）自然公园。水源样本来自阿斯图里亚斯北部至南部和东部至西部的十个地点，包括Fuentes del Narcea、Ibias y Dega?a（DEG）、Redes（RED）、La Mesa-Ubi?as（LaM）、Ponga（PON）和Picos de Europa（PEVF、PEBEL、PELH）自然公园内的地点，以及Urbiés山脉（MU2和MU11）和Pría沿海地区。

**2.3. 基因毒性分析：SMART检测**

使用Oregon K品系的黑腹果蝇黄色（Ok-y）和白色（Ok-w）菌株以及表面处理方法（46）进行了SMART检测。具体操作如下：从Ok-y雌性与Ok-w雄性的杂交后代中选取第二至第三龄幼虫，在Caroline Instant Drosophila培养基（Formula 4-24）中培养，每瓶加入1.5毫升不同样品溶液。孵化出的成虫眼睛根据描述进行评分（48）。所有实验中，阴性对照使用蒸馏水，阳性对照使用2.5 mM甲基磺酸盐（MMS）。每种溶液或浓度下每种性别各分析三百只眼睛。每瓶中孵化出的果蝇数量作为半定量毒性参数，具有至少一个突变斑点的眼睛频率用于确定基因毒性。

该检测方法用于分析不同浓度的水样和水提取物。水样直接按采集状态分析（UC，未浓缩），或通过冻干浓缩（MC；根据样品情况分为3-4倍或10倍浓缩，HC）。冻干后，样品用超纯水以不同的浓度重新悬浮。水溶性植物提取物的制备方法如前所述（46），但在某些实验中，提取物的制备时间延长至4小时、8小时和24小时，以检查其对提取物遗传毒性的影响。2.4 遗传毒性分析：彗星试验水溶性蕨类植物提取物的遗传毒性也在体外的人类细胞中通过彗星试验进行了分析（49）。来自人类肝癌细胞的HepG2细胞和来自人类胚胎非肿瘤肾脏的HEK-293细胞在含有高葡萄糖和L-谷氨酰胺（Biowest，法国）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，补充了10%（v/v）FBS和0.2% PlasmocinTM Prophylactic（InvivoGen，EEUU），在37°C、5% CO2和95%相对湿度条件下培养。传代时使用1X胰蛋白酶，在80-90%汇合度时进行。这些细胞在6孔板中用0.05、0.1、0.5和1 mg/mL的植物提取物浓度处理，通过0.2 μm NalgeneTM过滤器过滤以进行灭菌。彗星试验按照之前的方法进行（50, 51），每个凝胶中有10^5个细胞，使用预先涂有0.5%正常熔点琼脂糖的凝胶。凝胶在4°C下在黑暗中经过1小时的裂解（2.5 M NaCl、0.25 M NaOH、100 mM Na2EDTA、10 mM Tris、pH 10，以及10% DMSO和1% Triton X-100），然后进行20分钟的变性处理和20分钟的电泳，电泳条件为0.81 V/cm和300 mA，在1 mM Na2EDTA和300 mM NaOH pH13缓冲液中。之后，凝胶用0.4 M Tris缓冲液（pH 7.5）中和三次，每次5分钟，固定在绝对乙醇中并在室温下过夜干燥。载玻片被编码以便盲法分析，凝胶用0.4 μg/mL溴化乙锭和Vectashield?荧光保护剂（VECTOR laboratories, Inc. Burlingame）染色。使用Olympus BX61荧光显微镜和Olympus DP70数码相机，在400倍放大倍数下观察生成的核团，并拍摄每个凝胶至少50张照片。照片使用KOMET 5软件程序（Kinetic Imaging Limited，现属于Andor-Oxford Instruments，贝尔法斯特，英国）进行分析。用于测量DNA损伤的参数是彗星尾部的DNA百分比（% Tail DNA）。每个实验中每种浓度制备两个凝胶，每个细胞系进行3次独立实验。2.5 统计分析本工作中呈现的数据要么是算术平均值及其标准差（SDs），要么是频率及其标准差（SEs），标准差计算公式为p·q/√N，其中p是镶嵌眼的估计频率，q是1-p，N是评分眼睛的数量（48）。镶嵌眼的频率分析使用卡方检验进行。处理组中斑翅果蝇的数量与相应的阴性对照组使用Student’s t检验进行比较。变量之间的关系通过相关性和线性回归分析进行评估。代谢物含量使用Kruskal–Wallis检验后进行Dunn的事后检验。统计分析使用IBM SPSS程序（版本21.0.0.0）和R软件（版本4.4.1）（52）以及Rcmdr包进行，显著性水平设定为α = 0.05。3. 结果3.1 通过HPLC-PAD进行纯化跟踪提取和过滤后，对P. esculentum的提取物进行HPLC-PAD分析，发现色谱信号的保留时间与pterosins Ptr B和Ptr A相对应，通过与商业标准的直接比较得到确认，第三个信号暂时被归类为Ptr G（图S2）。提取物经过水解后，三个色谱信号的强度显著增加，这通过其紫外-可见吸收光谱（217、263和306 nm）和洗脱顺序得到了进一步证实。因此，这与先前的报告一致，表明所研究的植物物种含有高水平的PTE，其水解会产生Ptr G（47）。随后将提取物通过聚酰胺树脂处理，自由pterosins的信号消失（图S3）。为了便于识别糖基化衍生物，将提取物的一部分进行水解，并比较水解前后的色谱图谱，发现某些信号消失而其他信号同时增加。基于这种比较分析，使用SPE-HLB柱进一步纯化提取物。HPLC-PAD分析得到的组分显示出三个清晰分离的信号（图S4），其紫外-可见吸收光谱与文献中报道的illudane糖苷一致（47）。3.2 通过质谱和1H NMR分析进行色谱分馏和鉴定使用聚酰胺-SPE HLB处理的提取物在HPLC-DAD Agilent设备中进行相应的分馏，得到图S5中呈现的结果。一旦识别出与文献中报道的illudane糖苷吸收光谱匹配的信号，就将相应的组分分离并命名为R01、R02和R03。这些组分随后被冷冻并冻干以获得固体残留物。对于R03组分，观察到快速再水化的现象，表明其具有吸湿性。最终，在从Pteridium中分离出的R01、R02和R03组分中通过HPLC–PDA、UPLC–HRMS和1H NMR分析鉴定出三种糖基化illudanes（图S6）。R01组分在203 nm处显示紫外吸收，并具有与ptesculentoside（C20H30O9Na）一致的UPLC–HRMS特征离子，通过1H NMR确认其纯度为83.10%（图S7–S11，表S1）。R02组分在204 nm处显示紫外吸收，并具有与caudatoside（C21H32O9Na）一致的UPLC–HRMS特征离子，通过1H NMR确认其纯度为66.32%（图S12–S15，表S2）。R03组分显示与ptaquiloside（C20H30O8Na）一致的UPLC–HRMS离子，通过1H NMR确认其纯度为93.33%（图S16–S19，表S3）。总体而言，结果表明所评估的组分中同时存在PTE、CAU和PTA，并突显了色谱、质谱和NMR联合方法的可靠性。然而，CAU的纯度不足以将其用作定量分析的参考标准。因此，定量分析仅使用PTA、PTE、PtrB和PtrA作为分析标准。3.3 PTA、PtrB、PtrA和PTE的定量所有四种化合物（PTA、PTE、PtrA和PtrB）都在所有分析的植物样本中被检测到（图1）。在BRV地点（Somiedo自然公园）检测到异常高的PTA水平，该地区有牛死亡报告，其浓度达到mg g-1干重的范围。其他代谢物的最高水平也出现在该地点。尽管没有CAU的典型模式，但其相关代谢物PtrA的水平表明所有研究群体中都存在CAU，尤其是在BRV样本中。此外，还检测到了在欧洲纬度地区较少见的PTE。另一方面，Picos de Europa PEBEL地点的群体中检测到了PTA。下载：下载高分辨率图像（152KB）下载：下载全尺寸图像图1. 春季在阿斯图里亚斯地区的三个地点（Montes de Urbiés（MU2）、Somiedo自然公园（BRV）和Picos de Europa（PEBEL）收集的蕨类植物中illudane糖苷PTA、PTE以及pterosins PtrA和PtrB的水平。在从阿斯图里亚斯十个地点收集的水样中（表1），在四个地点（MU2、MU11、PON和RED）检测到PTA，其中PON的浓度最高。两种pterosins在所有样本中都被检测到，表明PTA和CAU广泛存在，即使没有直接定量。PTA仅在PRI和DEG中未检测到。最大浓度分别为PTA 1.6 μg L-1、PtrB 6.3 μg L-1、PtrA 2.8 μg L-1和PTE 2.6 μg L-1（图2）。下载：下载高分辨率图像（152KB）下载：下载全尺寸图像图2. 在受蕨类植物侵扰的几个地区收集的水样中illudane糖苷PTA、PTE以及pterosins PtrA和PtrB的水平。数据以算术平均值及其标准误差表示。Kruskal-Wallis检验未显示PTA、PTE和PtrB在不同地点之间存在显著差异。对于PtrA，尽管Kruskal-Wallis检验具有显著性，但在调整多重比较后，Dunn检验未显示地点间的成对差异。总体而言，这些发现表明该数据集中的代谢物浓度在各组之间没有差异。3.5 水样的遗传毒性分析使用SMART试验评估了选定水样（MU2、MU11、PEBEL和BRV）的遗传毒性（图3）。未观察到毒性。然而，浓缩样品引起的镶嵌眼频率高于对照组，表明具有遗传毒性。最高浓度（HC）使雌性和雄性的镶嵌眼频率均高于自发水平。中等浓度（MC）在所有样本中增加了镶嵌眼频率，除了BRV的雄性样本，在MU2和MU11的雌性样本中也增加了镶嵌眼频率。未浓缩样品未引起镶嵌眼频率高于阴性对照。此外，与水溶性植物提取物相比，水样中未检测到显著的重组现象（图S20）。下载：下载高分辨率图像（301KB）下载：下载全尺寸图像图3. 水样的毒性和遗传毒性分析。A) 每瓶中的斑翅果蝇数量作为毒性的指标，数字是至少4瓶的平均值及其相应的标准误差。阴性对照（NC）和未浓缩（1x或UC）、中等浓缩（3-4X或MC）以及高浓缩（10x或HC）处理组的镶嵌眼频率，B) 雌性，C) 雄性。数值是至少两个独立实验的频率及其相应的标准误差。处理组与相应阴性对照组的比较：* p< 0.05；** p< 0.01；*** p< 0.001。水样引起的镶嵌眼频率与代谢物浓度进行了比较（图1），未观察到显著关系。然而，水样中的遗传毒性反应与同一地点的水溶性植物提取物引起的反应显著相关（雌性R = 0.885，p < 0.001，10自由度；雄性R = 0.60，p < 0.05，10自由度）。3.6 水溶性植物提取物的遗传毒性进一步使用从与牛死亡相关的地点收集的额外BRV样本评估了阿斯图里亚斯植物样本的遗传毒性（图4）。所有测试的提取物浓度都使雌性的镶嵌眼频率高于对照水平，而在雄性中，除了最低浓度外，所有浓度都表现出这种效应。下载：下载高分辨率图像（173KB）下载：下载全尺寸图像图4. BRV植物提取物的遗传毒性分析。阴性对照（NC和PC）以及不同植物提取物浓度处理组的镶嵌眼频率。处理组与相应阴性对照组的比较：* p< 0.05；*** p< 0.001。将这些结果与之前发表的结果结合起来（46），与纬度的关系不再明显。此时，由于所有分析样本都有代谢物数据（17个样本），可以确认诱导的镶嵌眼频率与pterosin B水平之间存在统计学上的显著相关性（雌性分别为15自由度，R= 0.71，p< 0.01，R= 0.79，p< 0.001，R= 0.62，p< 0.01，对应1、10和25 mg/mL浓度；雄性分别为15自由度，R= 0.51，p< 0.05，R= 0.635，p< 0.01，R= 0.60，p< 0.05，对应1、10和25 mg/mL浓度）。此外，与pterosin A水平的统计显著相关性在雌性中也得到维持（15自由度，R= 0.65，p< 0.01，R= 0.65，p< 0.01，R= 0.48，p< 0.05，分别对应1、10和25 mg/mL浓度），并且在雄性中也发现了显著关系（15自由度，R= 0.56，p< 0.05，R= 0.64，p< 0.01，R= 0.54，p< 0.05，分别对应1、10和25 mg/mL浓度）。除了这项分析外，SMART试验还用于确定叶片衰老和水提取时间是否影响水提取物的遗传毒性（图5）。为此，将4月份收集的年轻叶片的水提取物与11月份在MU2和MU11地点收集的衰老叶片的水提取物进行了比较。结果如图5a所示，由老叶提取物在雌性中诱导的镶嵌眼频率显著低于由幼叶提取物诱导的频率，尽管即使在使用最高分析浓度（25 mg/mL）时，这些频率仍然高于相应的自发频率。相反，在雄性中（图5b），由老叶提取物诱导的镶嵌眼频率不仅低于由幼叶提取物诱导的频率，而且在任何情况下都与相应的自发频率没有差异。关于水提取时间对基因毒性活性的影响，除了2.5小时外，还研究了4小时、8小时和24小时的MU2和MU11样本。所得结果分别显示在图5c和d中，表明无论样本如何，镶嵌眼频率随着提取时间的增加而增加，尤其是在雌性中。通过垂直旋转连续搅拌24小时后获得的提取物诱导的镶嵌眼频率显著高于相应的自发频率，但低于8小时提取物诱导的频率。根据这些结果，很明显，迄今为止所有工作中使用的2.5小时提取时间是一个好的选择，也是出于实验室组织方面的实际考虑。

结果还表明，来自Pteridium植物水提取物的基因毒性活性在人类细胞（HepG2和HEK-293）中也进行了研究，使用彗星试验（comet assay）进行检测。结果显示，两种样本的提取物在最高分析浓度下均诱导了比自发频率更高的尾部DNA百分比。此外，提取物诱导的DNA损伤随着浓度的增加而增加，如剂量-反应回归分析所示，所有情况下的斜率均显著高于零（MU11-HepG2的b= 5.79 ± 1.30, p= 0.019；MU11-HEK-293的b= 6.71 ± 0.86, p= 0.003；TIN-HepG2的b= 5.73 ± 0.32, p= 0.0002；TIN-HEK-293的b= 4.74 ± 0.24, p= 0.00017）。这些数据还显示，两种样本在HEK-293细胞中诱导的损伤程度相当，但MU11在HepG2细胞中似乎诱导的损伤略多。

讨论部分指出，本研究考察了P. aquilinum在西班牙北部的发生情况和生物活性。在多个蕨类植物侵扰地区的植物组织和水样中量化了illudane糖苷，并评估了它们的基因毒性和化感作用。在报告有牲畜死亡事件的地区检测到高浓度的ptaquiloside，突显了这些发现的现实意义。此外，在果蝇和人类细胞实验中观察到的基因毒性进一步证实了蕨类植物化合物的生物活性。这些结果共同支持了一种环境暴露途径，将植物组织、水污染和生物效应联系起来，强调了需要采取有针对性的管理策略来减轻与蕨类植物增殖相关的生态和健康风险。这一观察在西班牙北部尤为重要，因为根据广泛的区域实地证据、农民调查和兽医观察，P. aquilinum在放牧系统中的增殖长期以来一直与牲畜健康问题和死亡事件相关。

在所有分析的样本中都检测到了四种化合物——ptaquiloside（PTA）、pterosin B（PtrB）、pterosin A（PtrA）和ptesculentoside（PTE），这表明illudane糖苷在西班牙北部的P. aquilinum种群中广泛存在。这一观察结果与先前的欧洲研究一致，这些研究报道了这些化合物在蕨类植物中的广泛地理分布。例如，在丹麦、瑞典和芬兰的66个地点分析了PTA、CAU和PTE，发现PTA是主要化合物，而CAU和PTE的相对丰度较低。早期研究（46）表明，pterosins A和B存在于所有14个阿斯图里亚斯采样地点，尽管存在明显的定量变化。在那项研究中，PtrA的水平范围为6至260 μg/g DW，而PtrB的浓度大约高一个数量级。将这项分析扩展到另外三个地点（其中两个与牲畜死亡事件相关），本研究表明PtrA和PtrB的浓度仍在先前报告的范围内。如一致观察到的，PtrB在所有地点都占主导地位，进一步证实了这种模式在不同地点的普遍性。

在所有17个分析地点的植物材料中检测到PtrA，支持了其相应糖苷前体CAU在阿斯图里亚斯蕨类植物种群中的广泛存在。此外，在BRV、PEBEL和MU2中检测到PTE值得注意，因为这种化合物在欧洲蕨类植物中仅被零星报道。其在多个地点的存在表明PTE在西班牙北部的种群中可能比之前认为的更为常见。这与定量LC–MS研究结果一致，这些研究表明CAU和PTE在某些蕨类植物种群中的浓度可与PTA相当。此外，有证据表明这两种化合物可能导致牲畜的不良影响。

本研究还考察了P. aquilinum在西班牙北部的发生情况和生物活性。在多个蕨类植物侵扰地区对植物组织和水样中的illudane糖苷进行了量化，并评估了它们的基因毒性和化感作用。在报告有牲畜死亡事件的地区检测到高浓度的ptaquiloside，突显了这些发现的现实意义。此外，在果蝇和人类细胞实验中观察到的基因毒性证实了蕨类植物化合物的生物活性。这些结果共同支持了一种环境暴露途径，将植物组织、水污染和生物效应联系起来，强调了需要采取有针对性的管理策略来减轻与蕨类植物增殖相关的生态和健康风险。这一观察在西班牙北部尤为重要，因为根据广泛的区域实地证据、农民调查和兽医观察，P. aquilinum在放牧系统中的增殖长期以来一直与牲畜健康问题和死亡事件相关。

在所有分析的样本中都检测到了四种化合物，这表明illudane糖苷在西班牙北部的P. aquilinum种群中广泛存在。这一观察结果与先前的欧洲研究一致，这些研究报道了这些化合物在蕨类植物中的广泛地理分布。例如，在丹麦、瑞典和芬兰的66个地点分析了PTA、CAU和PTE，发现PTA是主要化合物，而CAU和PTE的相对丰度较低。早期研究（46）表明，pterosins A和B存在于所有14个阿斯图里亚斯采样地点，尽管存在明显的定量变化。在那项研究中，PtrA的水平范围为6至260 μg/g DW，而PtrB的浓度大约高一个数量级。将这项分析扩展到另外三个地点（其中两个与牲畜死亡事件相关），本研究表明PtrA和PtrB的浓度仍在先前报告的范围内。如一致观察到的，PtrB在所有地点都占主导地位，进一步证实了这种模式的普遍性。

在所有17个分析地点的植物材料中检测到PtrA，支持了其相应糖苷前体CAU在阿斯图里亚斯蕨类植物种群中的广泛存在。此外，在BRV、PEBEL和MU2中检测到PTE值得注意，因为这种化合物在欧洲蕨类植物中仅被零星报道。其在多个地点的存在表明PTE在西班牙北部的种群中可能比之前认为的更为常见。这与定量LC–MS研究结果一致，这些研究表明CAU和PTE在某些蕨类植物种群中的浓度可与PTA相当。此外，有证据表明这两种化合物可能导致牲畜的不良影响。

尽管本研究并非正式的流行病学调查，但BRV地点值得注意，因为当地农民报告在三年期间有六头牛死亡，另有十头牛出现了严重的临床状况，最终需要屠宰。这些病例没有可用的兽医诊断，因此无法确定报告的牲畜损失与蕨类植物暴露之间的直接关系。然而，这些观察结果的频率与在西班牙北部200多个农场进行的基于问卷的调查中记录的牲畜损失一致，其他蕨类植物侵扰地区也报告了类似的病例。一些农民还报告称对这些病例进行了兽医评估，尽管这些信息无法独立验证。综合之前的调查观察和本次检测到的PTA、PTE、PtrA和PtrB，有助于填补关于西班牙北部环境中蕨类植物毒素暴露的知识空白，并为未来的兽医、环境和流行病学研究提供科学依据。

PTA能够渗入地表水和地下水，这引发了关于环境暴露和对牲畜及人类潜在风险的担忧。在这方面，研究了丹麦一个以蕨类植物为主的流域中的PTA水平，发现基流浓度低于61 ng/L，而暴雨事件期间的峰值可达2.2 μg/L，表明降雨可以触发PTA进入地表水的明显脉冲。此外，在以蕨类植物为主的地区浅层地下水井中检测到PTA的浓度约为0.35 μg/L。进一步扩展这一视角，在丹麦、瑞典和西班牙的地表水中检测了PTE、CAU和PTA的存在和稳定性（42）。在阿斯图里亚斯，PTE的浓度范围为0.4至5.3 μg/L，CAU的浓度范围为0.3至2.3 μg/L，而PTA未在地表水样本中检测到。相比之下，本研究的结果表明，在阿斯图里亚斯十个蕨类植物侵扰地区收集的水样中检测到了PTA、PTE以及pterosins PtrA和PtrB，表明这些化合物的地理分布广泛。这些发现突显了蕨类植物毒素的环境流动性，并强调了在以蕨类植物为主的地区监测地表水和地下水的重要性。

在多个收集的样本中进行了体内（果蝇）和体外（培养的人类细胞）的基因毒性分析。使用水样进行的体内分析显示，当样本浓缩至少3到4倍时，尤其是在雄性中检测到了基因毒性活性，这对于饮用该水的动物或人类可能具有相关性，这取决于摄入的水量，或者独立于水量，某些代谢物是否在暴露个体的某些组织或器官中积累（如金属、纳米材料和某些化学物质），或者水含量在一年中的某些时间可能会浓缩。检查结果时，基因毒性活性与体细胞突变的诱导有关，因为在任何情况下均未检测到有丝分裂重组。这一发现与在Pteridium植物水提取物中检测到的基因毒性活性不符，因为在后者中虽然重组诱导低于突变诱导，但总是可以检测到。此外，在SMART试验中总是可以检测到重组诱导（60, 61）。因此，这些样本中未检测到重组诱导表明可能存在一些不在植物中的因素，这些因素可能与植物浸出物相互作用，或者存在一些有毒的植物物质（14, 16, 39），其水平可能在水中积累并影响基因毒性。

当将分析限制在三个新研究的地点时，BRV地区的PTA水平明显高于PEBEL和MU2地区，表明存在强烈的地点依赖性变异。尽管这些浓度未达到其他地方报告的极端值（高达45 mg/g DW（26）），但BRV地区仍检测到了所有四种分析化合物的可检测水平。虽然本研究并非正式的流行病学调查，但BRV地区值得注意，因为当地农民报告在三年期间有六头牛死亡，另有十头牛出现了严重的临床状况，最终需要屠宰。这些病例没有可用的兽医诊断，因此无法确定报告的牲畜损失与蕨类植物暴露之间的直接关系。然而，这些观察结果的频率与在西班牙北部200多个农场进行的基于问卷的调查中记录的牲畜损失一致，其他蕨类植物侵扰地区也报告了类似的病例。一些农民还报告称对这些病例进行了兽医评估，尽管这些信息无法独立验证。综合之前的调查观察和本次检测到的PTA、PTE、PtrA和PtrB，有助于填补关于西班牙北部环境中蕨类植物毒素暴露的知识空白，并为未来的兽医、环境和流行病学研究提供科学依据。

PTA渗入地表水和地下水的能力引发了关于环境暴露和对牲畜及人类潜在风险的担忧。在这方面，研究了丹麦一个以蕨类植物为主的流域中的PTA水平，发现基流浓度低于61 ng/L，而暴雨事件期间的峰值可达2.2 μg/L，表明降雨可以触发PTA进入地表水的明显脉冲。此外，在以蕨类植物为主的地区浅层地下水井中检测到PTA的浓度约为0.35 μg/L（36）。扩展这一视角，在丹麦、瑞典和西班牙的地表水中检测了PTE、CAU和PTA的存在和稳定性（42）。在阿斯图里亚斯，PTE的浓度范围为0.4至5.3 μg/L，CAU的浓度范围为0.3至2.3 μg/L，而PTA未在地表水样本中检测到。相比之下，本研究的结果表明，在阿斯图里亚斯十个蕨类植物侵扰地区收集的水样中检测到了PTA、PTE以及pterosins PtrA和PtrB，表明这些化合物的地理分布广泛。这些发现突显了蕨类植物毒素的环境流动性，并强调了在以蕨类植物为主的地区监测地表水和地下水的重要性。鉴于采样区域的广泛空间覆盖范围以及检测这些化合物的分析挑战，值得注意的是，在一半的采样地点检测到了所有四种代谢物，而在其余地点至少检测到了两种或三种化合物。

在多个收集的样本中进行了体内（果蝇）和体外（培养的人类细胞）的基因毒性分析。使用水样进行的体内分析显示，当样本浓缩至少3到4倍时，尤其是在雄性中检测到了基因毒性活性，这可能对饮用该水的动物或人类具有相关性，这取决于摄入的水量，或者独立于水量，如果某些代谢物在暴露个体的某些组织或器官中积累（如金属、纳米材料和某些化学物质），或者水含量在一年中的某些时间可能会浓缩。检查结果时，基因毒性活性与体细胞突变的诱导有关，因为在任何情况下均未检测到有丝分裂重组。这一发现与在Pteridium植物水提取物中检测到的基因毒性活性不符，因为在后者中虽然重组诱导低于突变诱导，但总是可以检测到。此外，在SMART试验中总是可以检测到重组诱导（60, 61）。因此，这些样本中未检测到重组诱导表明可能存在一些不在植物中的因素，这些因素可能与植物浸出物相互作用，或者存在一些有毒的植物物质（14, 16, 39），其水平可能在水中积累并影响基因毒性。

当将基因毒性活性与检测到的代谢物水平进行比较时，未发现任何关系，这表明样本的基因毒性活性不依赖于代谢物水平，这表明基因毒性活性可能受到其他因素的影响。然而，在水样和侵染水源的植物的基因毒性活性之间发现了统计学上的显著关系。因此，由于植物中的基因毒性活性依赖于代谢物水平，样本中代谢物与基因毒性活性之间缺乏关系可能是由于在确定代谢物时水中的某些成分丢失或降解（42）。对BRV植物样本进行的体内基因毒性分析显示，考虑到采集地点的海拔和纬度，其基因毒性活性略高于预期，但与检测到的代谢物水平相比较低。这些结果可能解释了为什么当将这些数据与之前在阿斯图里亚斯其他样本中发布的数据结合时，之前发现的与纬度的显著关系不再存在。然而，仍然检测到了基因毒性活性与PtrA和PtrB含量之间的统计学显著关系，表明无论是否检测到illudane糖苷CAU和PTA，它们至少部分负责检测到的基因毒性。此外，由于体内基因毒性活性与代谢物含量相关，这可能用于比较不同发育阶段的植物（如幼叶或老叶）的风险，或研究制备水提取物所使用的时间的影响。所得结果显示，老叶的基因毒性活性显著低于幼叶，这表明代谢物含量不同，或者代谢物发生了降解（42）。此外，当这种植物与水混合以生成水提取物时，混合准备的时间对提取物的遗传毒性活性非常重要，由于雌性和雄性的混合时间不同，这可能会影响基因重组（61）。在体外培养的人类细胞中也研究了其遗传毒性活性。结果证实，水提取物能够导致DNA链断裂，这一点通过彗星试验得到了验证（24, 62, 63）。这种损伤可能是由于氮原子的烷基化作用引起的，在碱性条件下，这些烷基化位点会导致DNA单链断裂（37, 40, 64.5）。结论：本研究全面评估了P. aquilinum的分布和生物活性，量化了illudane糖苷PTA和PTE及其代谢产物pterosins A和B在体外培养的配子体和孢子体、春季采集的蕨类植物以及秋季水样中的含量，从而整合了植物组织和环境基质。实验室标准的使用使得化合物的定量更加准确，而遗传毒性试验则证明了这种物质能够在高等真核生物的体细胞中诱导突变和基因重组事件。此外，化感生物测定表明它可能对草本植物具有促进作用，这表明蕨类植物的生态作用比之前认识到的更为复杂。尽管P. aquilinum在生态和兽医领域具有重要意义，但在西班牙的相关研究仍然有限且分散。通过系统的毒素监测、有针对性的流行病学研究以及可持续管理策略的开发来填补这一空白对于保护牛的健康、农村经济以及潜在的人类健康至关重要，因为已知蕨类植物衍生的毒素具有致癌潜力。

作者贡献声明：
José Manuel Alvarez：撰写、审稿与编辑、方法学、资金筹集。
Ma Lucía Rodríguez：方法学。
Elena Canga：资金筹集。
L. María Sierra：撰写、审稿与编辑、方法学、资金筹集、数据分析、概念化。
Ana Velázquez：方法学。
Andrea Bartolomé：方法学。
Bernardo Barredo：方法学。
Iván Iglesias：方法学。
Isabel Feito：撰写、审稿与编辑、资金筹集、数据分析、数据管理。
Juan Majada：资金筹集。
Alexis E. Pe?a：撰写、审稿与编辑、方法学、数据分析。
Daniel Díaz：方法学。
Helena Fernández：撰写、初稿撰写、项目管理、资金筹集、概念化。
Ruth K. Hernández：资源。

未引用的参考文献：55。

资金支持：
本研究由西班牙科学与创新部资助，项目编号TED131270B-100，属于“恢复、转型与韧性计划”项目。