用于实时监测癌细胞内pH动态的色调可调生物发光传感器（AmyLuc）

《Analytical Chemistry》：A Color-Tuning Bioluminescent Sensor (AmyLuc) for Real-Time Monitoring of Intracellular pH Dynamics in Cancer Cells

　　

癌细胞因线粒体呼吸功能障碍和低氧导致葡萄糖摄取增加及乳酸分泌增多，从而引起肿瘤微环境（TME）胞外酸化及胞内碱化。此种代谢重编程促进恶性表型，包括侵袭增强、转移、多药耐药及免疫逃逸。因此，实时监测胞内与胞外pH动态对于理解肿瘤进展及评估治疗策略至关重要。本研究报道了一种pH敏感的生物发光颜色调谐（color-tuning）生物传感器，源自Amydetes vivianii萤火虫荧光素酶（AmyLuc），用于在人结肠腺癌细胞（Caco-2）中比值法估算与Warburg效应一致的代谢改变相关的胞内及胞外pH变化。以生物发光发射强度比I593nm（pH 6.0）/I548nm（pH 8.0）建立校准曲线以实现准确pH测定。绿色/红色发射比分析显示，线粒体解偶联剂FCCP（carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone，50 μM）与呼吸链抑制剂antimycin A（50 μM）处理诱导持续的胞内酸化（pH～6.3），而胞外环境逐渐碱化趋向近生理pH（～7.1），与培养基缓冲效应一致。此胞内酸化与代谢转变及胞质厌氧糖酵解过渡导致的胞内质子积累相符。结果凸显了AmyLuc作为敏感的颜色调谐生物发光pH生物传感器，适用于代谢应激及治疗干预下癌细胞pH动态的实时监测。

论文《A Color-Tuning Bioluminescent Sensor (AmyLuc) for Real-Time Monitoring of Intracellular pH Dynamics in Cancer Cells》发表在《Analytical Chemistry》。研究背景方面，细胞内pH（intracellular pH, pHi）维持对细胞稳态至关重要，其变化常反映细胞应激、毒性暴露及病理状态如炎症、免疫反应和癌症。生理条件下哺乳动物细胞质与胞外pH（extracellular pH, pHe）通常为7.2–7.4，细胞器如线粒体和溶酶体则发生显著pH波动，因此准确监测pH变化对追踪生理与病理状态十分关键。现有发光生物传感器和多pH指示剂大多依赖荧光强度测量，部分采用比值荧光策略提升精度并实现胞内胞外pH动态的时空监测；但荧光传感器需外部光激发，易引起光毒性和生物基质自发荧光，且绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）等易在细胞内蓄积，干扰实时精确监测。生物发光pH传感器可规避上述问题，例如基于生物发光共振能量转移（bioluminescence resonance energy transfer, BRET）的Phlash传感器结合了荧光素酶与荧光蛋白，可在无外源照明下灵敏监测胞内pH；然而BRET传感器要求荧光素酶–荧光素与荧光受体极近距离，且相互作用易受pH无关因素影响，限制精度。更高效的方法是采用单一荧光素酶，其发射光谱直接随pH变化而偏移。此前研究表明萤火虫荧光素酶可用作生物发光颜色调谐（color-tuning）生物传感器检测胞内pH和重金属浓度，如Macrolampis萤火虫荧光素酶已用于胞质与核内pH成像；但包括Macrolampis在内的许多萤火虫荧光素酶在37 °C下发射光谱已明显红移，降低光谱分辨率。Amydetes vivianii萤火虫荧光素酶（AmyLuc）在37 °C下显示稳定的蓝移发射，是哺乳动物细胞中高度适用的报告基因和pH传感器。癌细胞主要依赖有氧糖酵解供能，与线粒体呼吸受损和低氧相关；此重编程增加葡萄糖摄取和乳酸分泌，导致胞外酸化（pHe降低）和轻度胞内碱化（pHi升高），逆转的pH梯度是恶性肿瘤标志，促进增殖、代谢适应和抗凋亡，酸性肿瘤微环境主要源于乳酸增多及单羧酸转运蛋白和质子泵介导的质子外排，亦损害免疫监视，因此针对肿瘤pH正常化的治疗策略受到关注。FCCP（carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone）和antimycin A等药物已知可促进胞内酸化，分别作为线粒体解偶联剂和电子传递链复合物III抑制剂影响线粒体功能与代谢应激。鉴于实时胞内pH监测在癌细胞代谢转变与治疗干预中的重要性，本研究旨在探讨AmyLuc这一新型颜色调谐pH传感荧光素酶在人结肠腺癌细胞（Caco-2）中监测线粒体功能障碍及电子传递链抑制后厌氧糖酵解适应相关胞内pH变化的可行性。研究人员开展的研究是：构建基于AmyLuc的比值型生物发光pH传感体系，通过纯化AmyLuc在细胞-free体系中建立I₅₄₈/I₅₉₃发射比与pH（6.5–8.0）的校准曲线；将人源密码子优化的AmyLuc基因（pCMV-Amy）转染至Caco-2细胞获得Caco-2-AmyLuc细胞；在DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）或Hanks’平衡盐溶液（HBSS）中用线粒体解偶联剂FCCP（50 μM）和呼吸链抑制剂antimycin A（50 μM）处理，通过酶标仪扫描398–653 nm生物发光光谱，以I₅₄₈/I₅₉₃比值经校准曲线估算胞内与胞外pH随时间（0–105 min）的动态变化；胞外pH检测是在非转染细胞培养液中加入纯化AmyLuc、D-luciferin、MgSO₄和ATP后测光谱并比值计算；统计采用Student t检验或单因素方差分析（ANOVA），按ICH指南估算检出限（LOD）和定量限（LOQ）。得出的结论是：AmyLuc的I₅₄₈/I₅₉₃比值在pH 6.5–8.0内呈线性响应（R²≈0.95），LOD为0.10 pH单位，LOQ为0.30 pH单位；在DMEM高缓冲条件下胞内pH稳定于7.07–7.27、胞外pH偏碱（7.74–7.78），而在低缓冲HBSS中胞内基础pH约6.67、胞外从6.56升至7.14，更接近文献报道，故后续选用HBSS增强胞外pH敏感性；FCCP和antimycin A处理使胞内pH迅速降至约6.28–6.31（较对照降0.36–0.39单位）后稳定，对应代谢由氧化磷酸化转向厌氧糖酵解致质子与乳酸累积；胞外pH在初始酸性后15 min内逐渐碱化至近原始水平，反映HBSS缓冲效应强于质子外排积累，胞内持续酸化与胞外碱化凸显区间调控差异；葡萄糖浓度影响上，高糖增强未处理及antimycin A组的胞内进而胞外酸化，而FCCP相反。意义在于首次证实AmyLuc可比值法实时监测人结肠腺癌细胞胞内pH动态，为研究癌症模型中调控胞内pH稳态的化合物提供了低背景、无光毒性、长时程的动态生物发光传感工具，论文发表于《Analytical Chemistry》。

主要关键技术方法：研究人员采用的关键技术包括：从Amydetes vivianii克隆并密码子优化荧光素酶基因AmyLuc，构建真核表达载体pCMV-Amy并转染人结肠腺癌细胞系Caco-2（ATCC来源）获得稳定/瞬时表达细胞模型Caco-2-AmyLuc；在大肠杆菌BL21(DE3)中用pCold-Amy诱导表达His标签融合AmyLuc，经镍亲和层析纯化得到重组酶；在细胞-free体系中使用135 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5–8.0，含1 mM MgCl₂、1 mM CaCl₂、10 mM葡萄糖、20 mM NaCl）加纯化AmyLuc、D-luciferin、MgSO₄、ATP，通过酶标仪（Tecan Spark）扫描398–653 nm生物发光光谱，以548 nm与593 nm强度比（I₅₄₈/I₅₉₃）建立pH校准曲线；细胞实验分别在DMEM（高缓冲）和HBSS（低缓冲，5 mM或25 mM葡萄糖）中进行，处理组为50 μM FCCP或50 μM antimycin A，对照组为新鲜培养基；胞内pH通过转染细胞自身AmyLuc发光光谱比值估算，胞外pH通过在培养上清中加入纯化AmyLuc及底物/辅因子测光谱比值估算；时间动力学监测0–105 min，数据采集参数为积分时间1000 ms；统计学处理采用GraphPad Prism进行Student t检验或单因素ANOVA，按ICH指南由校准范围重复测量标准差（σ）和斜率（S）计算LOD=3.3σ/S、LOQ=10σ/S。

Calibration Curve with AmyLuc：研究人员使用纯化AmyLuc在pH 6.5–8.0范围内建立I₅₄₈/I₅₉₃比值随时间（0–105 min）的稳定性曲线，发现比值在各pH下随时间基本稳定，表明信号衰减或反应动力学对比值读数影响极小。以时间零点的比值与pH作线性回归，得线性区间pH 6.5–8.0（R²≈0.95），超出此范围线性关系偏离；据此校准曲线LOD为0.10 pH单位，LOQ为0.30 pH单位，可分辨≥0.2 pH单位的差异。AmyLuc不需外源激发光，避免了光漂白及荧光探头的常见假象，适合长时程动力学监测。

Evaluation of Basal Intracellular and Extracellular pH in Caco-2 Cells：研究人员在DMEM与HBSS两种缓冲条件下评估Caco-2细胞基础胞内及胞外pH。DMEM中胞内pH稳定在7.07–7.27（符合癌细胞报道范围7.1–7.8），胞外pH偏碱达7.74–7.78，高于典型肿瘤微环境（6.2–6.9）；HBSS中胞内基础pH初始6.67，30 min后稳于6.64–6.87，胞外从6.56升至7.14，更接近文献值。差异源于DMEM高缓冲容量（25 mM HEPES＋44 mM NaHCO₃）掩盖胞外pH变动，HBSS缓冲弱（4 mM NaHCO₃）提升胞外pH敏感性，故后续实验选HBSS。需注意当比值外推至校准范围外（如pH<6.5或>8.0）时应谨慎解释。

Effects of FCCP and Antimycin A in Intracellular and Extracellular pH：研究人员在HBSS（5 mM葡萄糖）中用50 μM FCCP或antimycin A处理Caco-2-AmyLuc细胞监测105 min。Intracellular pH：处理初始（T0）胞内pH即下降，FCCP组约6.28、antimycin A组约6.31，较对照（～6.67）降0.36–0.39单位，反映药物快速起效（与线粒体膜电位Δψ_m迅速消散文献一致）；随后胞内pH趋于稳定而非持续下降，暗示细胞pH调控机制抵消进一步酸化；酸化趋势符合电子传递链抑制及线粒体解偶联促使代谢转向厌氧糖酵解、胞内质子与乳酸累积，FCCP还可直接跨线粒体膜转运质子至胞质。Extracellular pH：起始胞外偏酸，前15 min内逐步碱化回升至接近原始水平，处理与对照趋势相似，表明初期碱化非处理特异性而是HBSS缓冲中和效应；胞外pH净轮廓是质子外排与介质缓冲平衡的结果，本条件下缓冲主导，故未见胞外酸化反而渐碱，与胞内持续酸化（～6.2–6.3稳定于30 min后）形成对比，显示胞内调控与胞外缓冲动态分离。补充实验表明葡萄糖浓度影响：高糖增强未处理及antimycin A组的胞内进而胞外酸化，FCCP则呈相反效果。

讨论部分总结：研究人员讨论指出，AmyLuc生物发光颜色调谐传感器首次实现人结肠腺癌细胞胞内pH动态的比值法实时监测，规避了荧光探针需外源激发、光毒性和自发荧光的缺陷；校准曲线在pH 6.5–8.0线性良好，LOD 0.10、LOQ 0.30 pH单位，时间稳定性强；缓冲条件选择是关键，DMEM高缓冲掩盖胞外pH变化，HBSS低缓冲更适合敏感检测胞外pH；FCCP和antimycin A迅速诱导胞内酸化至～6.3，对应线粒体功能障碍迫使代谢向厌氧糖酵解转换、质子累积，胞内pH后续稳定反映细胞pH调节机制作用；胞外pH在HBSS中渐碱，体现介质缓冲甚于质子外排积累；葡萄糖浓度调节代谢流从而影响pH动态，高糖加剧antimycin A诱导的酸化，FCCP下却减轻酸化。该AmyLuc平台为癌症模型代谢应激、药物干预下胞内pH稳态研究提供了特异、低背景、长时程动态生物发光工具。

Concluding Remarks翻译：在本研究中，研究人员首次表明pH传感萤火虫荧光素酶AmyLuc可有效用于比值法实时监测人结肠腺癌细胞内的胞内pH动态。利用多模式酶标仪，可随时间监测呼吸链抑制剂antimycin A和线粒体解偶联剂FCCP处理后的胞内pH变化。此方法能够研究不同药理或环境条件下反映在pH动态中的细胞响应，特别适用于研究癌症模型中调控胞内pH稳态的化合物。