《ACS Sustainable Chemistry & Engineering》：A Unified Analytical Method Greenness Score (uAMGS) Quantifies How Microscopic Imaging Is Greener Than Conventional Liquid Chromatography
编辑推荐：
绿色化学是一组用于评估、开发和实施更安全、更高效且对环境危害更小的方法的原则。分析方法绿色度评分（AMGS）是众多试图评估传统液相色谱（LC）的指标之一，其评估依据包括仪器能耗以及所使用溶剂的安全性、健康风险和环境影响。然而，在实际应用中，AMGS主要聚焦于制
绿色化学是一组用于评估、开发和实施更安全、更高效且对环境危害更小的方法的原则。分析方法绿色度评分（AMGS）是众多试图评估传统液相色谱（LC）的指标之一，其评估依据包括仪器能耗以及所使用溶剂的安全性、健康风险和环境影响。然而，在实际应用中，AMGS主要聚焦于制药行业中的传统分离方法，无法适用于前沿分离科学，包括微型化技术。为扩展其适用范围，研究人员在此提出了统一分析方法绿色度评分（uAMGS），该评分澄清并扩展了背后的数学原理，并纳入了量纲分析和不确定性分析，使其能够应用于更广泛的分析技术。uAMGS被用于比较两种不同方法的绿色度：单分子显微技术（SMM）和高效液相色谱法（HPLC），这两种方法被用于获取等效数据。uAMGS判定SMM显著比HPLC更绿色，主要原因是溶剂消耗量降低。总体而言，uAMGS应能使从本科生到工业界博士的化学工作者评估多种分离方法的绿色度。
**研究背景与问题提出**
实验评估和筛选色谱分离是一个能源密集型过程。在制药行业中，使用色谱法将药物推向市场需要大量的能源、溶剂和时间。在药物发现阶段，可能合成约103至10?个分子的化合物库，每个化合物可能需要分离至低纯度（约85%）或通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析后才能进行进一步的活性测试。这些分离的LC条件相当固定，尽管分离时间较短（<2分钟），但考虑到组合化学库的规模以及柱平衡、清洗、样品制备和进样所需的循环时间，能源消耗可能很高。进入制药科学阶段后，需要针对数十种不同的固定相、溶剂、流速等LC参数，对数百个有前景的药物候选物进行迭代式的分析方法开发，这一过程对单个化合物可能耗时数周至数月。在临床前和临床阶段，还需将单一已鉴定化合物的分离优化至高质量控制标准。手性化合物或生物大分子的分离进一步加剧了LC方法开发的复杂性。即便借助自动化和高通量技术，在开发单个药物的时间线上，LC每天可能消耗数升溶剂并需要24/7的仪器运行能源。因此，传统的整体色谱分离不仅绿色度低，而且在学术界、（生物）制药、能源化工、环境科学以及食品饮料生产等应用领域造成了巨大的成本。
**AMGS的提出与局限性**
分析方法绿色度评分（AMGS）于2019年由Hicks等代表美国化学学会绿色化学研究所（ACS GCI）制药圆桌会议提出，作为定量比较色谱方法绿色度的指标。该指标综合考虑了色谱仪器的能耗以及溶剂的安全性、健康风险和环境影响（SHE）以及溶剂的累积能源需求（CED），作为一种非竞争性的定量基准来比较分离方法。AMGS的计算器具有下拉菜单，包含HPLC、LC-MS、正相液相色谱（NPLC）、制备型LC-MS、制备型超临界流体色谱（Prep SFC）、SFC、SFC-MS、超高效合相色谱（UPC2）和超高效液相色谱（UPLC）等技术。然而，AMGS主要适用于传统的液相或亚/超临界流体分离，与其他可更广泛应用的绿色度评分相比（如分析绿色度指标AGREE），其应用范围受限。虽然AGREE等指标提供了方法绿色度的总体定性指示，但其固有的定量性不如AMGS。AMGS基于物理测量（如溶剂体积、仪器能耗），成功实现了对不同运行时间、溶剂和色谱柱分离相同分析物时客观实验值的相对比较。
然而，AMGS在产业界之外的应用受到其数学原理和假设的限制，即该指标仅用于标准商用LC或SFC仪器。文献索引显示约100-200篇稿件引用过AMGS，其中仅约30%使用了某种版本的AMGS来量化其方法的绿色度。随着分离科学通过微型化方法（包括微流控和定制仪器）不断进步，AMGS对领域中多种方法的适用性降低。这些进展旨在实现更小体积样品的更快分析，从而降低仪器运行时间和总溶剂体积需求，但AMGS在线计算器未涵盖这类技术，这为AMGS的应用和跨技术比较带来了根本性挑战。
此外，AMGS存在具体的局限性：首先是其数学表达式中的错误，包括应使用几何平均而非乘法因子、括号位置错误等，这些错误未在原报告中得到纠正，且在线计算器如何应用这些公式尚不明确。其次，AMGS结果以单一数字报告，缺乏对评分精度的度量，有效数字的选择也显得随意。基于原作者关于仪器能耗"约为40%"的比例因子说明，AMGS中显然存在大量未报告的不确定性。定量化学需要指标的精度以理解跨方法或报告比较值的统计显著性。
**SMM作为绿色替代方法**
单分子显微技术（SMM）是一种更绿色的色谱样品理解和评估方法，通过将检测尺度推进至单个分子的极限。SMM是一种自下而上的方法，利用荧光显微镜的灵敏度在流动相/固定相界面或其中检测单个分子分析物的动态行为，可识别导致前沿、拖尾或其他分离挑战的异常事件。与整体洗脱曲线中这些行为可能隐藏于系综平均中不同，SMM能更直接地探测分离背后的物理机制。研究人员最近应用三维超分辨荧光成像方法研究了微米直径的商品化固定相，并将显微结果与相同材料的整体HPLC进行了比较，证明单分子动力学分析直接预测了洗脱曲线的趋势，识别了由于固定相涂层导致的孔隙堵塞引起的传质限制机制。这表明SMM是一种能在工业放大和应用前帮助评估色谱树脂的工具，提供可补充后续常规分离的数据。使用SMM可实现微型化至微米级"色谱柱"，仅需约微克固定相、毫升级溶剂和纳摩尔浓度分析物，但此前缺乏标准化的指标来量化这种潜在的性能提升。
**uAMGS的建立**
在此，研究人员引入了统一AMGS（uAMGS）来确定SMM相对于传统HPLC的绿色度。uAMGS的目标有二：（1）提出可应用于任何液相分离的uAMGS，解释所有变量和数学表达式对绿色度精度的贡献；（2）应用uAMGS证明SMM筛选将绿色度提高了近两倍。
uAMGS基于仪器能耗、溶剂的平均SHE以及溶剂生产和处置的能源需求，按试验次数和获取的分析物信息量进行缩放。其数学表达式为：
uAMGS = RI/(p×A) × {εI + Σn[mn × (3√(SnHnEn) + CEDn/3.6 MJ/kWh)]}
其中，RI为重复次数，p为每次重复产生的洗脱曲线数，A为测定的分析物数量，εI为每次重复的仪器能耗（kWh/重复），mn为每次重复使用的溶剂n的质量（kg/重复），Sn、Hn、En分别为溶剂n的安全性、健康和环境指数，CEDn为溶剂n的累积能源需求。CED单位为MJ/kg溶剂，除以3.6 MJ/kWh以匹配kWh的能量单位。为保持与原AMGS报告一致，SHE和CED值均来自Hicks等的补充表格。
**不确定性分析**
鉴于过去文献中缺乏对分离绿色度的精度报告，研究人员明确提供了uAMGS精度报告的指导。Sn、Hn、En和CEDn来自参考表格，假设这些值相对精确且不会显著贡献于总体不确定性。RI、p和A为设定整数。因此，uAMGS总不确定性的最大贡献来自εI和mn。uAMGS的简化不确定性euAMGS通过误差传递计算，最终结果报告为uAMGS ± euAMGS，单位为kWh/分析物，并根据euAMGS的传统修约规则确定有效数字。
**实验方法**
HPLC实验在Shimadzu LC-20AD Prominence仪器上进行，使用REFLEX c-Cellulose-B（5 μm，5 cm × 4.6 cm）色谱柱和光电二极管阵列检测器（SPD-M20A）。样品为100 μM罗丹明6G的水性HEPES缓冲液，等度洗脱条件为70%乙醇和30%水性HEPES（20 mM，pH 7.33），流速0.5 mL/min，运行时间10.0分钟，柱温30°C。通过功率调节器和能耗监测器记录仪器能耗，三次重复实验确定平均能耗为0.080 ± 0.010 kWh/重复。
SMM实验采用高倾斜和层压光学片（HILO）荧光成像技术，对纳摩尔浓度的荧光素罗丹明6G进行成像。仪器包括自制显微镜（Olympus IX-73倒置显微镜）、CNI二极管激光器（532 nm）、z轴单轴平移纳米定位器（Physik Instrumente PIFOC P-725）配合100×油浸物镜（Olympus UAPON100XOTIRF，NA 1.49）以及EMCCD相机（Andor iXon Life 897）。使用1 nM罗丹明6G的20 mM HEPES缓冲液以5.0 ± 0.1 μL/min的流速通过流室。每个样品在三个不同区域成像，三重复实验共产生九条洗脱曲线，总溶剂用量仅0.45 ± 0.01 mL水。三次试验确定SMM能耗为0.172 ± 0.022 kWh/重复。
**研究结果**
**传统AMGS计算的局限性**
使用原始AMGS公式计算，HPLC和SMM的AMGS值分别为76.27和1.23，均低于原始报告中的范围（82.10–6412.27）。SMM值远低于原始报告范围的下限，突显了微型化对绿色度的改善。值得注意的是，AMGSHPLC（76.27）与AMGS在线计算器结果（62.21）存在差异，可能源于前述数学错误或计算器与公式的差异。由于在线计算器仅列出传统色谱方法且输入受限，无法计算SMM的AMGS值，这导致不一致性、未知的不确定性以及无法使用在线计算器确定SMM值。
**uAMGS量化SMM的绿色优势**
uAMGS计算确定HPLC和SMM的评分分别为0.301 ± 0.026 kWh/分析物和0.172 ± 0.022 kWh/分析物，两者具有显著差异（p = 0.0028，双尾t检验），这得益于uAMGS中不确定性的纳入。在本研究中，SMM数据取RI = 3和p = 3（即三重复，每重复三条洗脱曲线）。若考虑单个视野中数百个固定相颗粒的分析，p可显著增加至250，从而使uAMGS降至0.0021 kWh/分析物。
**能耗贡献分析**
溶剂使用的能耗是uAMGS评分差异的主要贡献因素。对于HPLC，尽管每重复仅需要5.0 mL乙醇/水溶剂混合物（或包括循环时间在内的7.2 mL），溶剂使用仍是主要因素。相比之下，SMM由于20 mm3的样品流室仅需0.45 mL水溶剂即可收集数百万单分子事件，溶剂贡献降至可忽略值。这种通过减少溶剂消耗和废物处置来改善绿色度的效果，与微型化方法（如微流控）以及降低流动相流速的LC进展相一致。SMM将体积流速降低了两个数量级（从0.5降至0.005 mL/min），并实现了溶剂体积的相应减少。
**HPLC循环时间的影响**
纳入HPLC循环时间溶剂使用对uAMGS值有影响，但在此实验中不显著。使用计算溶剂消耗量（基于流速和运行时间）和实测溶剂消耗量（包括循环时间）确定的uAMGS值分别为0.301 ± 0.026和0.311 ± 0.025 kWh/分析物，两者无显著差异（p = 0.7）。这是由于等度洗脱无需长时间平衡，循环时间被最小化。但循环时间相对于总运行时间显著的方法应考虑额外溶剂消耗。
**仪器能耗比较**
HPLC的仪器能耗（0.080 ± 0.008 kWh/重复）略低于SMM（0.172 ± 0.022 kWh/重复），这主要源于SMM重复所需时间更长（本工作中为1.5小时对10分钟）。然而，SMM单次重复获取的数据量（三重复九条洗脱曲线）远超HPLC（单次运行一条洗脱曲线）。此外，未来SMM的测量时间可缩短，因为本研究中进行的是需要比常规数据采集更多准备时间的理想精细测量。值得注意的是，原始AMGS报告的HPLC仪器能耗（0.644 kWh）基于大量假设（40%的列出能耗需求），与本研究中实际测量的两个HPLC仪器能耗存在巨大差异，这明确表明绿色度计算中需要对具体仪器进行能耗测量而非估算。
**uAMGS的广泛应用与教学价值**
uAMGS不仅适用于SMM，还可应用于纸基分离、制备分离、膜分离、金属有机框架/共价有机框架（MOF/COF）以及微流控等液相分离方法。uAMGS也可作为教学工具促进绿色化学原则的讨论，其相对权重和数学推理可用于本科及以上水平的教学，使新一代化学工作者更深入地思考绿色原则。具体而言，uAMGS涵盖了使用更少危害化学品、更安全溶剂以及改进能源效率的仪器设计等方面。
**局限性与未来方向**
与其他绿色度计算器类似，uAMGS最适合用于方法和技术间的比较，而非作为国际单位制（SI）的绝对能量当量。虽然本工作通过澄清术语和单位向绝对能耗指标迈进，但由于某些输入的确定方式，uAMGS仍最适用于多方法、技术或操作条件间的比较。
当前的uAMGS未考虑耗材消耗（如样品瓶、吸头、注射器等）、计算机分析能耗、特定化学品（如衍生化试剂、缓冲液等）以及设备制造、安装或维护的差异。未来的工作可进一步完善SHE的透明度，开发更一致的S、H、E最终值计算程序。此外，SHE项在量纲分析中的不一致性（SHE为无量纲值，无法以能量单位报告）是AMGS和uAMGS的共同局限，未来研究可通过改进SHE计算或将其作为独立项与能量及安全/健康/环境成本分开考虑来解决。研究人员鼓励该领域和ACS GCI制药圆桌会议继续讨论，以开发具有公认单位的、与SHE相关的定量稳健绝对指标。
**研究结论**
统一分析方法绿色度评分（uAMGS）的开发扩展了传统色谱分离和制药行业之外的应用范围，其背后的数学原理、精度和单位分析得到了清晰描述。通过对等效方法SMM和HPLC的uAMGS评估，证明了SMM是显著更绿色的方法。该工作分解了应纳入绿色度的不同因素、各因素的相对重要性及其局限性，并表明uAMGS能够捕捉微型化、正交性和多重性等前沿测量科学的优势。
