基于两步熔解曲线分析检测鱼源停乳链球菌似马亚种(Streptococcus dysgalactiae)的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法

《BMC Methods》：qPCR assay with a two-step melt curve for the detection of Streptococcus dysgalactiae in fish

　　

背景：链球菌病是由无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、海豚链球菌(S. iniae)及停乳链球菌似马亚种(S. dysgalactiae)等引起的造成经济损失的鱼类细菌性疾病。目前已有无乳链球菌和海豚链球菌的qPCR检测方法，但尚无针对水产养殖中S. dysgalactiae的定量检测方法。鉴于S. dysgalactiae日益成为养殖鱼类致死病原且具人畜共患潜力，亟需建立灵敏特异的检测方法以支持水产健康管理。方法：研究人员评估了靶向16S–23S rRNA基因间隔区(ITS)和核糖核苷水解酶基因(rihC)的两对已发表引物对S. dysgalactiae的检测效率，选用较优引物集建立SYBR Green法qPCR(qPCR)并引入两步熔解曲线分析(two-step melt-curve analysis)以确保结果判读可靠。对方法进行分析灵敏度、针对其他鱼类病原体的分析特异性评价，并应用于自然感染罗非鱼样本验证实用性。结果：ITS靶向引物比rihC引物扩增效率更高而被选用。优化后qPCR检测限(LOD)为81.7拷贝，相当于每反应100 fg细菌DNA，且与非靶病原体无交叉反应。田野样本应用证实该方法可从自然感染罗非鱼中检出S. dysgalactiae，显示其诊断潜力。讨论：所建立的qPCR可实现鱼源S. dysgalactiae的分子检测，两步熔解曲线分析辅助结果解读。该法系首个针对水产养殖中S. dysgalactiae的qPCR方案，可为水产病害监测、诊断及防控提供有价值工具。

本研究发表于《BMC Methods》。

研究背景：链球菌病（streptococcosis）是危害全球水产养殖业的重要细菌性疾病，主要由无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、海豚链球菌（S. iniae）及停乳链球菌似马亚种（S. dysgalactiae，又称停乳链球菌停乳亚种类马亚种／马链球菌停乳亚种相关血清群C/G/L菌株）引起，临床可见突眼（exophthalmia）、游动异常及急性死亡。虽已有S. agalactiae和S. iniae的qPCR（quantitative real-time PCR，实时荧光定量PCR）检测方法，但迄今尚无针对水产源S. dysgalactiae的定量分子检测方案；现有针对S. dysgalactiae的PCR多为普通终点PCR（endpoint PCR），需后续电泳且无法定量，且多源自牛乳腺炎研究领域。由于S. dysgalactiae在养殖鱼类（如amberjack、cobia、罗非鱼Oreochromis spp.）中致病报道增多并具有人畜共患潜力，开发灵敏、特异、可定量的qPCR方法是水产健康管理的迫切需求。本研究旨在评估已有引物并建立适用于鱼源S. dysgalactiae检测的SYBR Green qPCR体系，并解决ITS（16S–23S rRNA internal transcribed spacer，16S–23S rRNA基因间隔区）扩增子因GC含量不均产生双熔解峰易被误判为非特异扩增的问题。

主要关键技术方法：研究人员选取文献中靶向S. dysgalactiae 16S–23S rRNA间隔区（ITS）及核糖核苷水解酶基因（rihC，ribonucleoside hydrolase gene）的两对引物，先进行in silico特异性分析；以煮沸法提取自泰国患病罗非鱼分离的S. dysgalactiae（菌株3588、3625）基因组DNA为阳性模板，通过梯度退火温度（55–65 ℃）和引物浓度（100 nM、200 nM）筛选最优qPCR条件，使用KAPA SYBR FAST Master Mix在Bio-Rad CFX Connect系统扩增，比较两对引物的C_q值、扩增效率及熔解曲线；以软件uMELT Quartz进行ITS amplicon熔解曲线in silico预测并与实验熔解曲线比对；通过10倍系列稀释模板建立标准曲线确定分析灵敏度（LOD）及扩增效率(E)、决定系数(R²)；以包括其他鱼类病原菌DNA及病毒感染组织DNA在内的17份非靶样本评价分析特异性；采集2022年泰国6个养殖场表现链球菌病临床症状（n=46）及表观健康（n=24）罗非鱼（尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus与红杂交罗非鱼Oreochromis sp.）肝肾混合组织，改良苯酚?氯仿法提取DNA，应用优化后qPCR检测，Fisher精确检验分析检出与临床状态关联。

研究结果：

Evaluation of ITS and rihC primer sets（ITS与rihC引物集评价）：研究人员以两株S. dysgalactiae分离株DNA为模板进行SYBR Green qPCR，ITS引物C_q≈14，rihC引物C_q≈28，因ITS为基因组多拷贝区域而rihC为单拷贝故ITS灵敏度更高。特异性测试中ITS引物仅扩增S. dysgalactiae，无非靶扩增；rihC引物（去除原探针改SYBR Green法后）出现非特异熔解峰。ITS产物经琼脂糖凝胶电泳为单一锐带，但其熔解曲线（ramp rate 0.5 ℃/step）出现双熔解峰（约76.5 ℃和84.0 ℃），in silico分析显示与ITS序列GC含量分布不均有关，对照人CFTR exon 13亦有相似双峰现象，证实双峰源于异质性GC而非引物二聚体或非特异产物。综合扩增效率与特异性，选定ITS引物进行后续优化。

Melt curve analysis and two-step strategy（熔解曲线分析与两步策略）：常规单一熔解曲线易将ITS amplicon双熔解峰误判为非特异扩增。研究人员测试三种升温速率（0.5 ℃、1.0 ℃、1.3 ℃/step），0.5 ℃可清晰分辨双峰，1.0 ℃双峰欠清晰，1.3 ℃呈单一宽峰。据此提出两步熔解曲线分析法——先以较低分辨率（1.3 ℃ ramp）确认无非特异产物宽峰，再以较高分辨率（0.5 ℃ ramp）捕捉特征性双峰模式，辅助正确判读ITS扩增特异性。

Evaluation of primer concentration and annealing temperature（引物浓度与退火温度评估）：在55–65 ℃退火温度梯度下，较低退火温度C_q值偏低；200 nM引物浓度较100 nM进一步降低C_q，提高扩增效率。综合考虑效率与特异性，最终选定退火温度65 ℃、引物终浓度各200 nM（10 μM储存液各加0.4 μL于20 μL体系）。最终qPCR反应体系：2 μL模板DNA（4–200 ng），10 μL 2× KAPA SYBR FAST Master Mix，0.4 μL各引物（10 μM），7.2 μL无核酸酶水；循环条件：95 ℃ 3 min；40×(95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s)；熔解曲线分两步：(i) 65–95 ℃，ramp 1.3 ℃/step，65 ℃预孵育1 min；(ii) 65–95 ℃，ramp 0.5 ℃/step。

qPCR performance of the S. dysgalactiae ITS assay（S. dysgalactiae ITS qPCR分析性能）：10倍系列稀释敏感性试验显示LOD为81.7拷贝／100 fg基因组DNA/反应，对应C_q=36.14±0.12，以此设阳性C_qcut?off。标准曲线扩增效率E=72.5%，R²=0.997，拷贝数计算公式：copy number = 10^{((C_q– 43.885) / –4.226)}。效率略低于理想90–110%可能与ITS amplicon GC分布不均影响引物结合及聚合酶延伸有关。特异性试验对17种非靶病原DNA/组织无交叉扩增。

Detection of S. dysgalactiae in fish samples（鱼源样本中S. dysgalactiae检测）：70份罗非鱼样本（病鱼46份、健康鱼24份，来自泰国6个养殖场）中13份qPCR阳性（18.5%），分布于3个养殖场，细菌负荷估算为2.23×10⁴–3.77×10⁶拷贝/反应。病鱼阳性率11/46（23.9%）高于健康鱼2/24（8.3%），但Fisher精确检验P＞0.05无统计学显著关联，可能反映健康鱼潜伏感染或临床病鱼由其他链球菌（如S. agalactiae、S. iniae）引起。结果证明该方法可用于田间样本筛查。

讨论与结论翻译：研究人员建立了可检测鱼组织中S. dysgalactiae的qPCR方法，引入两步熔解曲线分析辅助结果解读。本方法代表首个针对水产养殖中S. dysgalactiae的qPCR检测方案，可为水产病害监测、诊断及控制提供有价值的工具。局限性在于未设内标（建议加测鱼类管家基因如β?actin或EF?1α作内对照）、未分析S. dysgalactiae基因型差异、DNA提取与qPCR未采用随机盲法，未来需扩大样本量并与参比方法比较以正式评估诊断敏感性与特异性。