牛黄通过双重机制恢复肠-肝轴胆汁酸与脂质稳态改善原发性硬化性胆管炎

《Chinese Medicine》：Calculus Bovis ameliorates primary sclerosing cholangitis via a dual-pronged mechanism restoring bile acid and lipid homeostasis in the gut-liver axis

　　

目的：原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)是一种缺乏FDA批准疗法的进行性胆汁淤积性肝病。牛黄(Calculus Bovis, CB)为源于动物胆结石的传统药物，历来用于肝胆疾病治疗，但其在PSC中的治疗潜力与机制尚未明确。本研究旨在探讨CB在实验性PSC模型中的疗效并阐明其潜在机制。方法：采用0.1% 3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可力丁(DDC)饲料饲喂4周诱导PSC小鼠模型。小鼠分别给予CB（50、100、150 mg/kg/天）或熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid, UDCA, 100 mg/kg/天)。评估肝损伤、纤维化、肠屏障完整性、胆汁酸(bile acid, BA)谱和脂质水平。分析肝与肠中与BA及脂质代谢相关的基因/蛋白表达。综合转录组学、网络药理学及体外含药血清药理学阐析机制。结果：CB给药显著减轻DDC诱导小鼠的肝损伤、纤维化及肠屏障损害；恢复肠-肝轴BA稳态，使血清与肝中异常的BA谱正常化，同时增加粪便BA排泄；改善血脂异常，降低肝与血清脂质水平。机制上，CB及其生物活性BA组分通过双重机制发挥作用：（1）激活SIRT1-PGC-1α轴，转录上调肝与肠中核受体FXR(farnesoid X receptor)和PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor α)的表达；（2）直接配体依赖性激活FXR和PPARα蛋白功能。这种协同激活增强了BA解毒、转运及脂肪酸β-氧化的转录。体外实验中，抑制SIRT1或拮抗FXR/PPARα会减弱这些保护作用。结论：CB通过肠-肝轴调节BA与脂质稳态减轻实验性PSC，机制涉及SIRT1-PGC-1α通路激活与直接受体激动的新型双重机制。这些发现不仅凸显CB作为PSC治疗的多靶点候选药物的价值，还为肠-肝轴代谢调控提供了新见解。

研究背景：原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)是一种以肝内外胆管炎症与纤维化为特征的进展性胆汁淤积性肝病，目前缺乏美国食品药品监督管理局(FDA)批准的特异性治疗药物。标准治疗药物熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)虽可改善部分患者的生化指标，但未能证实可延缓疾病进展或提高生存率；终末期患者仅能依靠肝移植，且移植后复发风险高。肠-肝轴(gut-liver axis)在PSC发病机制中起核心作用，胆汁酸(bile acid, BA)稳态失衡会导致肝细胞内有毒BA蓄积、氧化应激、炎症及纤维化，并与肠屏障受损、菌群失调、脂质代谢异常形成恶性循环。靶向单一核受体如法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)激动剂奥贝胆酸或过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα)激动剂贝特类药物在临床PSC治疗中进展有限，提示复杂多因素疾病需多靶点协同干预。牛黄(Calculus Bovis, CB)为传统动物源药物，历代用于肝胆疾病，但现代药理机制尤其在PSC中的作用完全未明。研究人员据此设计研究，系统评价CB在实验性PSC模型中的疗效并阐明其是否通过肠-肝轴网络起效及是否涉及上游能量与代谢感知通路，论文发表于《Chinese Medicine》。关键技术方法：研究人员采用0.1% 3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可力丁(DDC)饲料饲喂C57BL/6小鼠4周建立PSC模型，设置CB低、中、高剂量（50、100、150 mg/kg/天）与UDCA阳性对照（100 mg/kg/天）灌胃干预；对CB进行药典质控与液质联用定量分析；制备CB含药血清（SD大鼠灌胃CB 375 mg/kg，取腹主动脉血制得）及人工胆汁酸混合物(artificial bile acid mixture, ABA)模拟入血BA组分；应用肝转录组测序、网络药理学（SwissTargetPrediction预测靶点、多数据库获取PSC靶点、STRING与Cytoscape构建互作网络、DAVID富集分析）、靶向BA代谢组学（LC–MS/MS检测血清、肝、回肠、粪便中50种BA）、实时荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光、组织染色（H&E、Masson、Oil Red O）、分子对接（AutoDock对接FXR、PPARα与关键BA组分）、体外细胞实验（HepG2、Caco-2细胞用DDC造模，干预用CB含药血清、ABA、胆红素及SIRT1抑制剂SIRT1-IN-1、FXR拮抗剂Z-guggulsterone、PPARα拮抗剂MK-886）；部分实验辅以粪便16S rRNA测序分析菌群；统计采用GraphPad Prism进行t检验与单因素方差分析（ANOVA）加Tukey事后检验。研究结果：CB ameliorates DDC-induced liver injury, fibrosis, and intestinal barrier damage（CB减轻DDC诱导的肝损伤、纤维化与肠屏障损害）：研究人员通过体内实验发现，CB剂量依赖性地改善DDC小鼠体重与肝重量下降，降低血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)；组织学上减轻坏死、炎性浸润、胆管增殖（CK19标记）、细胞凋亡（Cleaved Caspase-3标记）、胶原沉积（Masson与羟脯氨酸定量）及氧化应激（丙二醛MDA下降、谷胱甘肽GSH上升）；同时改善回肠绒毛萎缩、炎性浸润及紧密连接蛋白ZO-1丢失，上调Tjp1、Oldn3、Ocln等紧密连接基因；高剂量CB多数参数优于UDCA，且正常小鼠高剂量CB干预未见心肝脾肺肾及生化毒性，提示安全性。Transcriptome analysis and network pharmacology link the therapeutic effects of CB to the modulation of BA and lipid metabolism（转录组与网络药理学将CB疗效关联至BA与脂质代谢调控）：研究人员对DDC+Veh与DDC+CB（150 mg/kg）肝组织转录组分析发现2030个差异表达基因，GO与KEGG富集于代谢过程、转运蛋白活性、PPAR信号、类固醇生物合成、脂肪酸降解、胆汁分泌等；基因集富集分析(GSEA)显示“胆汁酸生物合成过程”“脂肪酸β-氧化”等正向富集；网络药理学以CB入血BA组分为活性成分预测435个靶点，与四个数据库交叉得到的1568个PSC靶点取交集得166个重叠靶点，蛋白互作网络提示FXR(NR1H4)与PPARα(PPARA)为核心节点，GO/KEGG同样富集BA与脂质代谢通路。CB ameliorates DDC-induced PSC by modulating enterohepatic BA profiles（CB通过调节肠肝BA谱改善DDC诱导PSC）：研究人员用靶向BA代谢组发现CB使血清与肝中总BA、初级BA、次级BA、结合BA、游离BA异常水平恢复正常，使初级/总BA、初级/次级BA、亲水/疏水BA比值等趋向生理，增加粪中总BA、次级BA、游离BA及次级/总BA比，提示促进菌群去结合与次级BA生成及粪便排泄；16S rRNA测序显示CB逆转DDC下调的Akkermansia、Faecalibaculum等产次级BA菌属，与BA表型一致。CB normalizes the expression of key genes regulating BA metabolism and transport（CB恢复调控BA代谢与转运的关键基因表达）：研究人员通过定量PCR与Western blot发现CB剂量依赖性上调肝经典(Cyp7a1、Cyp8b1)与替代(Cyp27a1)合成酶、BA代谢酶(Cyp3a11、Baat、Bacs、Ugt1a1)，恢复肝 canalicular外排转运蛋白Bsep、Mrp2，正弦摄取Ntcp、Oatp1及外流Mrp4至接近正常，下调回肠ASBT(apical sodium-dependent bile acid transporter)摄取转运蛋白mRNA与蛋白，上调回肠Ibabp、Ostα、Ostβ等外排相关转运蛋白，从而协同减少肝BA蓄积并促进肠到粪便排泄。CB ameliorates disordered lipid metabolism across the gut-liver axis in DDC-induced PSC mice（CB改善DDC小鼠肠-肝轴紊乱的脂质代谢）：研究人员发现CB剂量依赖性纠正DDC引起的血清总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)升高与游离脂肪酸(FFA)降低，降低肝FFA与TCHO，减少肝脂滴(Oil Red O)，下调肝脂合成基因Acc1、Fasn，上调肝脂肪酸β-氧化基因Cd36、Acsl1、Cpt1a、Acox1、Hmgcs2，抑制胆固醇合成酶Hmgcr，上调肝与回肠胆固醇外流转运蛋白Abcg5/Abcg8，下调肝脂蛋白脂酶Lpl、上调Angptl4（抑制TG水解），从而系统性改善脂质稳态。CB modulates BA and lipid homeostasis through upregulating intestinal and hepatic FXR/PPARα through the SIRT1-PGC-1α axis（CB通过SIRT1-PGC-1α轴上调肠与肝FXR/PPARα调控BA与脂质稳态）：研究人员验证转录组提示CB选择性剂量依赖性上调肝与回肠Fxr、Pparα的mRNA与蛋白（而非其他核受体），增加下游靶基因Shp（FXR靶）、Fgf15（肠FXR靶）、Fabp1（PPARα靶）；筛选上游发现Sirt1与Pgc-1α（PGC-1α）显著上调，CB提升肝与肠SIRT1、PGC-1α的mRNA与蛋白，提示CB激活SIRT1-PGC-1α轴进而转录上调FXR与PPARα。In vitro validation of CB-mediated upregulation of FXR/PPARα through the SIRT1-PGC-1α axis（体外验证CB通过SIRT1-PGC-1α轴上调FXR/PPARα）：研究人员在HepG2与Caco-2细胞用DDC造模，CB含药血清剂量依赖性上调SIRT1、PGC-1α、FXR、PPARα的mRNA与蛋白及下游靶基因(SHP、FGF19、FABP1、OSTβ、UGT1A1、IBABP)；预加SIRT1抑制剂SIRT1-IN-1阻断该轴的上调效应；FXR拮抗剂Z-guggulsterone特异性抑制FXR靶基因，PPARα拮抗剂MK-886特异性抑制PPARα靶基因，二者联合最强抑制共同靶基因；人工胆汁酸混合物(ABA)模拟CB入血BA组分可重现CB含药血清对SIRT1-PGC-1α-FXR/PPARα轴的激活，胆红素仅微弱影响FXR靶，表明原型BA组分是激活该轴的主要物质。CB components directly bind to and activate FXR and PPARα（CB组分直接结合并激活FXR与PPARα）：研究人员通过分子对接显示CB入血关键BA（鹅脱氧胆酸CDCA、胆酸CA、脱氧胆酸DCA、猪去氧胆酸HDCA等）可稳定嵌入FXR与PPARα配体结合口袋（结合能?6.57至?10.05 kcal/mol）；细胞实验证实CDCA、CA、DCA上调FXR靶基因，CDCA、CA、HDCA上调PPARα靶基因FABP1，但不改变Fxr/Pparα本身的mRNA，说明CB BA组分既可转录上调受体表达（通过SIRT1-PGC-1α），又可作直接配体激活受体功能。讨论部分总结：研究人员在讨论中指出，PSC缺乏有效药物，肝移植受限且有复发风险；本研究临床前证据显示CB通过双重机制改善实验PSC：一是CB入血BA组分激活SIRT1-PGC-1α轴转录上调肝与肠FXR和PPARα表达，二是CB BA组分作为内源性配体直接激活FXR与PPARα蛋白功能，协同增强BA解毒、外排转运及脂肪酸β-氧化相关基因转录，从而恢复肠-肝轴BA与脂质稳态，减轻肝损伤、纤维化与肠屏障损害。整合多组学与网络药理学锁定FXR、PPARα为核心靶点；CB选择性上调FXR、PPARα而非其他核受体，进而调控下游BA合成酶（Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1等）、代谢酶（Cyp3a11、Baat、Ugt1a1等）、转运蛋白（肝Bsep、Mrp2、Ntcp；肠Asbt、Ostα/β、Ibabp）及脂质代谢基因（Cpt1a、Acox1、Angptl4、Abcg5/8等）；SIRT1-PGC-1α上游机制经体内外抑制实验确认；ABA实验排除胆红素主要作用，明确原型BA为激活SIRT1-PGC-1α轴的核心物质；分子对接与细胞实验证实直接配体激活；该“转录增敏+直接激动”双重策略避免单靶点局限与联合用药不良反应；CB剂量小鼠50–150 mg/kg/天对应人等效剂量4.06–12.17 mg/kg/天，低端与《中国药典（2025年版）》临床用量（2.5–5.83 mg/kg/天）吻合，且高剂量未见毒性，安全窗较好；针对资源稀缺可改用人工培育牛黄（收录于药典，药效相近，成本低，提高可及性）；局限在于缺乏体内组织特异性Sirt1敲除验证、具体哪种BA单体通过何种受体上调SIRT1未明、菌群因果作用仅初步16S关联未完成无菌或定植验证、DDC模型未完全模拟人PSC所有特征，需在Mdr2^?/?等模型进一步验证临床转化潜力；结论为CB通过肠-肝轴双重机制恢复BA与脂质稳态减轻实验PSC，是具前景的多靶点候选药物，也为肠-肝轴代谢互作治疗提供了新框架。