创灵液通过抑制ACSS2/ACSL4轴抑制角质形成细胞铁死亡从而缓解糖尿病足溃疡

《Chinese Medicine》：Chuangling Ye mitigates diabetic foot ulcer through suppressing keratinocyte ferroptosis via inhibiting ACSS2/ACSL4 axis

　　

背景：糖尿病足溃疡(Diabetic Foot Ulcers, DFU)是糖尿病严重并发症，角质形成细胞铁死亡(Ferroptosis)可加速其病理进程。创灵液(Chuangling Ye, CLY)临床常用于DFU治疗且具抗炎促再生作用，但其药理机制未明。方法：DFU大鼠予CLY(0.225和0.45 g/mL)处理21 d评估疗效；UPLC-MS/MS分析CLY化学成分；网络药理学、Western blot及免疫组化评估CLY抗铁死亡效应；以铁死亡诱导剂RSL3验证保护作用；以晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products, AGEs)处理HaCaT细胞建立体外角质形成细胞铁死亡模型；RNA测序阐明分子机制；质粒过表达验证ACSS2/ACSL4轴功能；分子对接筛选CLY中靶向ACSS2的活性成分。结果：CLY显著加速DFU大鼠伤口愈合，网络药理学提示调控铁死亡，并改善脂质过氧化和铁超载；RSL3削弱CLY保护效应；CLY抑制AGEs诱导的脂质过氧化和活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)升高；机制上CLY通过抑制ACSS2介导的ACSL4乙酰化降低ACSL4蛋白稳定性；分子对接鉴定6种CLY主要成分可靶向ACSS2。结论：CLY通过抑制ACSS2介导的ACSL4乙酰化进而抑制角质形成细胞铁死亡促进DFU愈合，为DFU治疗提供潜在方案。

论文解读：创灵液通过抑制ACSS2/ACSL4轴抑制角质形成细胞铁死亡缓解糖尿病足溃疡

研究背景与立项依据

糖尿病足溃疡(Diabetic Foot Ulcer, DFU)是糖尿病常见微血管并发症，约19%~34%糖尿病患者受累，截肢率高达20%，5年死亡率约30%。持续高血糖及有害代谢物蓄积致慢性炎症和血管损伤，阻碍愈合。目前临床策略以降糖和早期干预为主，新型敷料、细胞因子疗法等因成本高、疗效不稳定受限。角质形成细胞(Keratinocyte, KC)再上皮化是创面愈合关键，高糖环境下KC易发生铁死亡——一种铁依赖性的、以脂质过氧化和铁超载为特征的调节性细胞死亡方式，其关键驱动蛋白为长链脂酰辅酶A合成酶4(Acyl-CoA Synthetase Long-Chain Family Member 4, ACSL4)，可促进膜磷脂中多不饱和脂肪酸掺入从而增加脂质过氧化敏感性。ACSL4的K383位点乙酰化可抑制其泛素化降解、增强蛋白稳定性、促进铁死亡。乙酰辅酶A合成酶短链家族成员2(Acyl-CoA Synthetase Short-Chain Family Member 2, ACSS2)可在代谢紊乱状态下催化乙酸生成乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)，为蛋白乙酰化提供底物并促进非组组蛋白乙酰化修饰。创灵液(Chuangling Ye, CLY；由大黄Rhei Radix et Rhizoma、红花Carthami Flos、诃子Chebulae Fructus、黄蜀葵花Abelmoschi Corolla组成)临床用于皮肤溃疡疗效确切，但其促DFU愈合的分子机制，尤其是对角质形成细胞铁死亡及ACSS2/ACSL4轴的调控尚不清楚。该研究旨在明确CLY是否通过抑制ACSS2介导的ACSL4乙酰化抑制角质形成细胞铁死亡从而促进DFU愈合。本文发表于Chinese Medicine。

主要技术方法

研究人员采用链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)联合高脂饮食诱导的SD大鼠DFU模型，设模型组、CLY低剂量(0.225 g/mL)组、CLY高剂量(0.45 g/mL)组及重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rb-bFGF)阳性对照组，局部每日给药共21 d，以创面愈合率、组织学染色及免疫组化评价疗效；以铁死亡诱导剂RSL3进行机制验证。CLY化学成分经UPLC-MS/MS鉴定，结合TCMSP、GeneCards及OMIM数据库行网络药理学分析。以AGEs诱导人永生化角质形成细胞HaCaT建立体外铁死亡模型，CLY含药血清处理，检测脂质过氧化产物(MDA、4-HNE)、GSH、SOD、Fe²⁺及ROS；电镜观察线粒体形态；Western blot检测铁死亡及乙酰化相关蛋白。RNA测序分析CLY干预后差异表达基因及通路富集。环己酰亚胺(CHX)追踪实验检测ACSL4蛋白半衰期；蛋白酶体抑制剂MG132验证泛素-蛋白酶体降解途径。ACSS2过表达质粒转染验证其对CLY效应的挽救作用。分子对接分析CLY主要成分与ACSS2的结合亲和力，并对候选单体进行体外功能验证。

研究结果

CLY accelerates diabetic wound healing and angiogenesis（创灵液加速糖尿病创面愈合和血管生成）

研究人员通过STZ诱导DFU大鼠模型给予CLY治疗发现，CLY显著降低创面面积，增加新生表皮厚度、胶原沉积率及血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)表达，效果与阳性药rb-bFGF相当，证实CLY促进DFU愈合及血管生成。

Network pharmacology analysis of CLY in treating DFU（创灵液治疗DFU的网络药理学分析）

UPLC-MS/MS鉴定CLY中353个潜在靶点，与DFU疾病靶点取交集后经KEGG富集显示"Ferroptosis（铁死亡）"通路显著富集，PPI网络中GPX4、ACSL4、FTH1等铁死亡核心基因为关键节点，提示CLY可能通过调控铁死亡发挥疗效。

CLY inhibits ferroptosis and lipid peroxidation in DFU rats（创灵液抑制DFU大鼠体内铁死亡和脂质过氧化）

CLY处理使DFU大鼠创面组织中升高的丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、4-羟基壬烯醛(4-Hydroxynonenal, 4-HNE)及Fe²⁺含量降低，谷胱甘肽(Glutathione, GSH)水平回升；Western blot及免疫组化显示转铁蛋白受体1(Transferrin Receptor 1, TFR1)和ACSL4下调，谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4, GPX4)及铁蛋白重链(Ferritin Heavy Chain, FTH)上调，证实CLY在体内抑制铁死亡相关指标。

CLY accelerates diabetic wound healing through inhibiting ferroptosis（创灵液通过抑制铁死亡加速糖尿病创面愈合）

联合应用铁死亡诱导剂RSL3可逆转CLY促愈合、促表皮再生及上调VEGF的作用，确认CLY的治疗效应依赖于对铁死亡的抑制。

CLY reduces ferroptosis in AGEs-induce HaCaT cells（创灵液减少AGEs诱导的HaCaT细胞铁死亡）

400 μg/mL AGEs处理HaCaT细胞建立铁死亡模型，CLY干预后MDA、4-HNE、Fe²⁺、ROS下降，GSH和SOD升高；ACSL4、TFR1下调，GPX4、FTH上调；电镜示线粒体皱缩和嵴减少被CLY逆转，证明CLY在体外抑制角质形成细胞铁死亡。

CLY suppresses ferroptosis through reducing ACSL4 protein stability（创灵液通过降低ACSL4蛋白稳定性抑制铁死亡）

RNA-seq显示CLY使铁死亡通路基因集显著受抑，且CLY不改变ACSL4 mRNA水平但降低其蛋白量。CHX追踪实验表明CLY缩短ACSL4蛋白半衰期；加用蛋白酶体抑制剂MG132可阻断CLY引起的ACSL4降解。CLY同时降低ACSL4 K383位点乙酰化水平(acetyl-ACSL4)，表明CLY通过抑制ACSL4乙酰化促进其经泛素-蛋白酶体途径降解、降低蛋白稳定性。

CLY inhibits ACSL4 expression associated with reducing acetyl-CoA production and acetylation modification（创灵液通过降低乙酰辅酶A生成和乙酰化修饰抑制ACSL4表达）

CLY下调AGEs诱导升高的ACSS2及ACLY(Acetyl-CoA Synthetase Long-Chain Family Member 2, ACLY)蛋白表达，上调SIRT1表达，降低细胞内乙酰辅酶A含量；在体DFU组织中同样见ACSS2/ACLY上调及乙酰辅酶A升高被CLY逆转。外源性补充乙酰辅酶A可抵消CLY对ACSL4去乙酰化及抗氧化应激的保护作用，说明CLY抑制ACSL4乙酰化与减少乙酰辅酶A生成相关。

CLY inhibits ACSL4 acetylation through decreasing ACSS2 expression（创灵液通过下调ACSS2表达抑制ACSL4乙酰化）

ACSS2过表达可恢复细胞内乙酰辅酶A水平及ACSL4乙酰化，逆转CLY对脂质过氧化指标(MDA、4-HNE↓, GSH↑)和铁死亡标志物(TFR1、ACSL4↓, GPX4、FTH↑)的改善作用，证实ACSS2是CLY调控ACSL4乙酰化及角质形成细胞铁死亡的关键靶蛋白。SIRT1敲减不影响CLY对ACSL4乙酰化的抑制，说明该作用不依赖SIRT1上调。

Identification of active ingredients targeting ACSS2 in CLY（鉴定CLY中靶向ACSS2的活性成分）

分子对接显示异槲皮苷(Isoquercitrin, IQ)、大黄酸(Rhein)、槲皮素(Quercetin)、鞣花酸(Ellagic acid)、佛手柑内酯(Bergapten)、天麻素(Gastrodin)与ACSS2结合能均<-7 kcal/mol，其中IQ与ACSS2多个残基形成氢键；体外验证IQ可降低乙酰辅酶A、ACSL4蛋白及其乙酰化水平，抑制脂质过氧化和铁超载。

讨论与结论总结

既往研究显示高糖环境中角质形成细胞ACSL4上调促铁死亡，ACSL4 K383乙酰化通过抑制其K48连接的多聚泛素化增强蛋白稳定性。本研究发现AGEs条件下ACSS2升高→乙酰辅酶A增多→ACSL4乙酰化↑→ACSL4稳定聚集→促铁死亡；CLY下调ACSS2及ACLY、上调SIRT1、降低胞内乙酰辅酶A，减少ACSL4乙酰化使其经蛋白酶体降解，从而抑制角质形成细胞铁死亡、促进再上皮化和DFU愈合。SIRT1敲减实验排除CLY作用单纯通过SIRT1介导的去乙酰化，明确ACSS2下调是关键环节。研究还指出CLY可能通过多成分协同调控磷酸化等过程影响炎症和血管生成，且对其他细胞(如成纤维细胞)铁死亡的抑制值得进一步探讨。ACSS2作为糖尿病肾病中已知促损伤因子，本研究将其拓展至DFU病理及中药干预机制中，为DFU共享治疗靶点提供依据。

结论翻译：研究人员证实创灵液(Chuangling Ye, CLY)通过抑制ACSS2介导的ACSL4乙酰化，抑制角质形成细胞铁死亡，从而促进糖尿病足溃疡(Diabetic Foot Ulcer, DFU)创面愈合，凸显了CLY作为DFU合理治疗方案的潜力及ACSS2/ACSL4轴作为DFU治疗靶点的价值。