《Tropical Animal Health and Production》：Detection of Pasteurella multocida and macrolide resistance genes in calf pneumonia: an immunohistochemical and molecular approach
编辑推荐：
本研究旨在通过免疫组织化学（IHC）方法检测肺炎犊牛福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺组织中的多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida），并使用实时PCR（real-time PCR）在阳性病例中调查大环内酯类耐药基因（erm(42), ms
本研究旨在通过免疫组织化学（IHC）方法检测肺炎犊牛福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺组织中的多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida），并使用实时PCR（real-time PCR）在阳性病例中调查大环内酯类耐药基因（erm(42), msr(E), mph(E)）的存在。在从100头尸检犊牛收集的肺组织中，组织病理学分析显示纤维蛋白性支气管肺炎是最常见的诊断（56/100）。使用特异性产生的多克隆抗体，在100例中的55例（55%）中免疫组织化学检测到多杀性巴氏杆菌。在纤维蛋白性支气管肺炎病例中观察到多杀性巴氏杆菌的最高流行率（82%）。在55例IHC阳性病例中，有39例（71%）检测到至少一种目标大环内酯类耐药基因。最常见的耐药谱是msr(E)+mph(E)组合（n=12;22%）和三基因组合erm(42)+msr(E)+mph(E)（n=12;22%）。总之，本研究表明多杀性巴氏杆菌在犊牛纤维蛋白性肺炎中起关键作用，并且这些菌株携带高水平和多样类型的大环内酯类耐药基因，可能导致治疗失败。因此，建议在兽医实践中进行常规分子耐药性筛查和制定合理的治疗策略。
牛呼吸道疾病（Bovine Respiratory Disease, BRD）是导致犊牛发病和死亡的主要原因之一，给全球畜牧业带来重大经济损失。多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, P. multocida）作为BRD复杂病因中的重要细菌性病原体，是急性纤维蛋白性支气管肺炎的主要诱因。该菌通常作为条件致病菌定殖于上呼吸道黏膜，在运输、饲料变化、气候应激或病毒感染等条件下，可迁移至下呼吸道并引发严重肺损伤。大环内酯类抗生素（如替米考星、泰地罗新等）因长效性和良好组织渗透性被广泛用于BRD治疗，但近年来耐药性日益加剧。已有研究表明，耐药基因erm(42)、msr(E)和mph(E)在不同组合中可显著提高最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC），导致治疗失败。然而，传统细菌培养和药敏试验在抗生素治疗史或组织自溶的病例中常无法检出病原，存在漏诊风险。为此，研究人员开展本研究，旨在通过免疫组织化学（IHC）方法检测肺炎犊牛福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺组织中的多杀性巴氏杆菌，并结合实时PCR（real-time PCR）筛查IHC阳性病例中上述三种大环内酯类耐药基因的携带情况，为优化诊断和合理用药提供科学依据。该论文发表在《Tropical Animal Health and Production》。
本研究的主要关键技术与方法包括：样本队列来源于2012至2017年间送至Sel?uk大学兽医学院病理学系进行尸检的100头肺炎犊牛的肺组织；采用组织病理学（苏木精-伊红H&E染色）对肺炎类型进行分类；使用自制的抗多杀性巴氏杆菌多克隆抗体进行免疫组织化学染色以检测病原；利用实时PCR（TaqMan水解探针技术）检测阳性病例中大环内酯类耐药基因erm(42)、msr(E)和mph(E)。其中，抗体通过小鼠高免血清制备，并经PCR确认菌株身份；实时PCR的DNA提取自FFPE组织。
研究结果：
大体检查结果：通过对100头犊牛肺组织的大体观察，多数病例呈现红棕色肝变区分布于颅侧和尾侧肺叶，伴有小叶间隔显著增宽、胸膜表面黄白色纤维蛋白渗出及胸膜粘连。部分样本切面有浑浊脓性渗出物或脓液，少数肺组织呈海绵状弹性并见肋骨压痕。纤维蛋白性支气管肺炎病例的肺小叶边缘清晰，胸膜表面晦暗覆有纤维蛋白；卡他性肺炎见不规则红色区域和浆液黏液渗出；化脓性脓肿形成性肺炎出现局部厚壁脓腔；间质性肺炎则无肺萎陷，质地弹性，表面平滑，伴有结节性病变和胸腔积液。
组织病理学结果：根据H&E染色镜检，100例犊牛肺组织被分类为：纤维蛋白性支气管肺炎（包括纤维蛋白性、纤维蛋白化脓性、纤维蛋白坏死性）56例（56%），卡他性支气管肺炎18例，卡他性化脓性支气管肺炎7例，化脓性脓肿形成性肺炎6例，间质性肺炎11例，吸入性肺炎1例，肉芽肿性肺炎1例。纤维蛋白性支气管肺炎表现为红色和灰色肝变期，肺泡间隔充血，肺泡腔内有中性粒细胞、脱落上皮细胞和密集纤维蛋白索，小叶间隔因纤维蛋白渗出显著增厚，部分病例出现不规则坏死灶和燕麦细胞形成。卡他性肺炎有浆液黏液渗出、局灶性肺气肿和轻度中性粒细胞浸润；化脓性病例显示厚壁脓肿伴大量中性粒细胞和坏死物。间质性肺炎以单核细胞浸润、纤维化和周围淋巴样增生为特征。
免疫组织化学结果：在100例肺组织中，55例（55%）检测到多杀性巴氏杆菌阳性免疫反应，呈棕色DAB沉积于中性粒细胞、肺泡巨噬细胞以及支气管和肺泡上皮细胞胞质中。按肺炎类型分析，纤维蛋白性支气管肺炎阳性率最高（46/56, 82%），其次为卡他性支气管肺炎（6/18, 33%），间质性肺炎（2/11, 18%），其他类型（吸入性肺炎1例, 7%）。化脓性脓肿形成性和肉芽肿性肺炎未检出阳性。
实时PCR和耐药基因结果：在55例IHC阳性病例中，39例（71%）检测到至少一种大环内酯类耐药基因。单独基因检测率：erm(42) 2例（3.6%），msr(E) 5例（9.1%），mph(E) 7例（12.7%）。双基因组合：msr(E)+mph(E) 12例（21.8%），mph(E)+erm(42) 1例（1.8%）。三基因组合erm(42)+msr(E)+mph(E) 12例（21.8%）。16例（29.1%）未检测到任何目标耐药基因。按肺炎类型分析，纤维蛋白性支气管肺炎的46例IHC阳性中35例（76%）携带耐药基因，基因型多样性最高，包括5例单独msr(E)、6例单独mph(E)、11例msr(E)+mph(E)、1例mph(E)+erm(42)以及12例三基因组合。卡他性支气管肺炎的6例阳性中有3例（50%）携带耐药基因（2例erm(42)单独，1例msr(E)+mph(E)），间质性肺炎的2例阳性中1例检出mph(E)单独，其他类型仅1例阳性但未检出耐药基因。
讨论部分总结：讨论指出，IHC方法有效规避了传统培养在抗生素治疗和自溶组织中的局限性，为病原鉴定提供了可靠替代。本研究中IHC检出率（55%）与组织病理学中纤维蛋白性肺炎的高发（56%）一致，且82%的纤维蛋白性肺炎病例呈现P. multocida阳性，证实该菌是此类病变的核心病原。耐药基因总检出率（71%）与前期报道（60-80%）相近，但在严重治疗无效的致命病例中可能更高（76-95%）。最常出现的msr(E)+mph(E)组合和三基因组合均与已知耐药机制相关：msr(E)编码ATP结合盒转运体促进药物外排，mph(E)编码磷酸转移酶使大环内酯类失活，二者常协同作用；erm(42)编码甲基转移酶修饰23S rRNA靶位，赋予高水平耐药。携带上述组合的菌株可使MIC值升高达1024倍，在感染中导致治疗失败。三基因组合的高频率（22%）提示整合性接合元件（ICE）可能介导水平基因转移，加速耐药传播。约29%的IHC阳性病例未检出目标基因，可能涉及23S rRNA基因突变或本研究未覆盖的其他耐药标记（如tet(H)、bla
OXA-2、ant(2″)-Ia等），提示耐药谱可能更广。综上，治疗抵抗性感染已成为犊牛肺炎致死的重要促进因素。研究结论翻译：本研究强调了多杀性巴氏杆菌在犊牛呼吸道感染病因学中的突出作用，尤其是在纤维蛋白性支气管肺炎中。在福尔马林固定石蜡包埋组织上联合应用免疫组织化学和实时PCR，当经典培养技术不足时提供了一种实用可靠的诊断替代方案。此外，多杀性巴氏杆菌菌株中大环内酯类耐药基因的高流行率表明存在显著的耐药负担，必须在治疗计划中予以考虑。常规分子耐药监测和制定针对性治疗策略对于减少肺炎相关的犊牛死亡率和改善兽医实践中的治疗结果至关重要。
