第二代凝集素微阵列(lectin microarray)用于治疗性抗体(therapeutic antibodies)的高通量聚糖谱(glycan profiling)分析

《AAPS Open》：Second-generation lectin microarray for high throughput glycan profiling of therapeutic antibodies

　　

N-连接糖基化(glycosylation)是治疗性单克隆抗体(mAb)的关键质量属性(CQA)，影响疗效、安全性和药代动力学。因此准确且高通量的聚糖谱分析对产品质量与生产一致性至关重要。研究人员评估了一种新型凝集素微阵列(lectin microarray)平台，用于检测治疗性抗体中常见聚糖表位。为评估特异性和性能，研究人员通过化学酶法糖工程(chemoenzymatic glycoengineering)制备了一组具有均一聚糖结构的抗HER2 mAb。这些抗体同时采用凝集素微阵列对完整抗体进行谱分析，以及基于质谱(MS)的释放聚糖表征，两种结果高度一致，证明凝集素微阵列具备半定量能力以实现准确聚糖谱分析。进一步研究确认了该平台的动态范围(dynamic range)和中间精密度(intermediate precision)。用阿达木单抗(adalimumab)参比品和8个生物类似药(biosimilar)进行评估，进一步证实其作为治疗性抗体表征补充工具的实用性。综上，这些发现确立了凝集素微阵列作为治疗性抗体开发中稳健、高通量的聚糖分析方法。

该研究发表于《AAPS Open》。研究背景方面，N-连接糖基化是治疗性单克隆抗体(mAb)的关键质量属性(CQA)，直接影响抗体的效应功能、安全性、药代动力学与产品质量。截至2025年5月，美国FDA已批准209个治疗性抗体（160个原研药、49个生物类似药），其中IgG1类占73%，其Fc区Asn297位点的保守N-连接糖基化可携带30余种N-聚糖物种，微异质性会显著调控Fcγ受体介导的效应功能。ICH Q6B等法规明确要求对碳水化合物含量、糖基化位点、寡糖序列、分支与连接方式进行全面表征，因此在开发与生产中需对聚糖组成进行准确、高通量监测以保证产品一致性。传统标准工作流程需经PNGase F酶解释放N-聚糖、荧光标记（如2-AB、RapiFluor-MS）、亲水相互作用液相色谱(HILIC)分离、质谱(MS)结构鉴定与峰面积相对定量，步骤繁琐、耗时较长、需破坏完整蛋白结构且存在低丰度聚糖丢失风险；而第一代凝集素微阵列(lectin microarray)虽可在完整蛋白水平检测特定聚糖表位，但因含45种凝集素且部分产生非特异性信号，限制了数据解读与标准化应用。为此研究人员开展本研究，目的是基于治疗性抗体中最普遍存在的9种聚糖表位设计并评估第二代凝集素微阵列的性能，明确其特异性、动态范围、中间精密度，并在均一糖型模型抗体和真实治疗性抗体（阿达木单抗原研药与生物类似药）中验证其作为传统质谱方法互补平台的价值。

研究人员采用几个主要关键技术方法：样本方面包括通过化学酶法糖工程制备的具有明确定义且均一糖型（Ab-G0、Ab-G0F、Ab-G1F 3-arm、Ab-G1F 6-arm、Ab-G2、Ab-G2F、Ab-S2G2、Ab-S2G2F）的抗HER2 mAb面板，以及来源于商业化渠道的阿达木单抗参比品（3个批次）与8个已批准生物类似药；分析技术方面并行采用基于滤膜辅助样品制备(FASP)、还原烷基化、PNGase F释放N-聚糖、还原、固相甲基化permethylation与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的释放聚糖表征流程，以及第二代凝集素微阵列（LecChip-IgG-mAb，14孔/片，每孔打印9种凝集素各3重复，采用Cy3标记完整抗体、消逝场荧光检测、不同曝光时间采集信号并经专用软件分析净荧光强度）；平台性能评估方面包括用Ab-G0F与Ab-G2F等量混合样本进行系列稀释以测定核心岩藻糖(core fucose)、末端GlcNAc、末端β-半乳糖(terminal β-Gal)表位的动态线性范围，以及跨天、跨芯片的中间精密度（%CV）评价；应用验证方面基于阿达木单抗原研药数据建立均值±3倍标准差的接受标准，评估各生物类似药聚糖表位谱是否在范围内。

研究结果如下：

Lectin microarray workflow design and verification（凝集素微阵列工作流程设计与验证）：研究人员构建了含14孔、每孔9种凝集素三重复的LecChip-IgG-mAb，所选凝集素可识别治疗性IgG抗体常见聚糖表位（核心岩藻糖、末端GlcNAc、末端β-Gal、高甘露糖(high mannose)、末端α-Gal、α2,3-NANA、α2,6-NGNA、三天线(triantennary)、平分GlcNAc(bisecting GlcNAc)）。用Cy3标记完整抗HER2 mAb获得基于各表位对应凝集素斑点荧光强度的半定量聚糖结合谱。均一糖型模型确认微阵列信号与预期表位一致：例如Ab-G0仅强显末端GlcNAc表位，Ab-G0F显示核心岩藻糖与末端GlcNAc信号，Ab-G2以末端β-Gal为主、Ab-G2F显示核心岩藻糖加末端β-Gal，Ab-G1F变种均显示末端β-Gal与一定末端GlcNAc，Ab-S2G2与Ab-S2G2F（部分脱唾液酸后仍）显示强α2,6-唾液酸与中等末端β-Gal信号；高甘露糖、α2,3-唾液酸、末端α-Gal、三天线表位均无信号，符合工程糖型设计；平分GlcNAc表位在所有样本中均无非特异结合（PHAE凝集素存在对非末端GlcNAc/β-Gal的非特异信号，但S2G2类无此信号因PHAE不结合唾液酸化糖链）。以上通过与MALDI-TOF MS释放聚糖谱高度一致的结果，证明了微阵列的特异性。

Evaluation of anti-HER2 mAbs with defined glycans（具定义聚糖的抗HER2 mAb评估）：研究人员通过MALDI-TOF MS确认8个化学酶工程抗HER2 mAb的释放N-聚糖组成，其中Ab-G0、Ab-G0F、Ab-G2、Ab-G2F为100%均一目标糖型，其余含少量次要组分（如Ab-G1F 3-arm含12.2% G0F，Ab-S2G2与Ab-S2G2F在运输存储后有部分脱唾液酸分别剩70.4% S2G2、64.4% S2G2F，次要多为S1G2/S1G2F）。凝集素微阵列信号模式与MS鉴定结构完全匹配：例如仅含G0的Ab-G0只激活末端GlcNAc凝集素；G0F同时激活核心岩藻糖（rPhoSL）与末端GlcNAc（rOTH3）；G2激活末端β-Gal（RCA120），G2F额外激活核心岩藻糖；S2G2/S2G2F激活α2,6-唾液酸（rSNA-I）与末端β-Gal，S2G2F也见较低核心岩藻糖信号（rPhoSL对唾液酸化糖亲和降低）。微弱非特异信号如某些样本在RCA120上有低末端β-Gal背景、在α2,6-唾液酸通道有弱信号（可能与末端β-Gal存在有关）均被记录。结果证实微阵列可区分核心岩藻糖有无、Gal/GlcNAc延伸、α2,6-唾液酸化等关键表位，且与MS互补。

Determination of dynamic range for most abundant glycan epitopes（最主要聚糖表位的动态范围测定）：研究人员用1:1混合的Ab-G0F与Ab-G2F（经MS确认各自100%均一）进行Cy3标记后系列稀释（2000至15.6 ng/mL），在三档曝光时间测试。发现最高浓度2000 ng/mL超出所有凝集素线性范围（排除后分析），1秒曝光时核心岩藻糖、末端GlcNAc、末端β-Gal的线性范围均达0–1000 ng/mL（R²≥0.98）；2秒曝光时核心岩藻糖与末端GlcNAc线性缩至0–500 ng/mL，末端β-Gal仍达0–1000 ng/mL；10秒曝光时核心岩藻糖与末端GlcNAc线性仅0–125 ng/mL，末端β-Gal为0–250 ng/mL；高于线性范围可出现荧光自淬灭。最终选用125 ng/mL为优化抗体浓度（在1秒与2秒下均处于线性区内）。不同表位信号强度差异反映凝集素-聚糖亲和差异而非直接丰度比例，平台适用于相对比较而非绝对定量。

Intermediate precision of tailored lectin microarray method（定制凝集素微阵列方法的中间精密度）：研究人员在125 ng/mL（1:1 Ab-G0F:Ab-G2F混合）条件下跨两天、每天两片芯片（每片4样本）共16重复，用IQR法剔除各凝集素1个离群值后算%CV。1秒曝光时日间CV为核心岩藻糖24.9%、末端GlcNAc23.6%、末端β-Gal35.6%；2秒曝光得到近似数值；片内CV范围为核心岩藻糖7.0%–29.2%、末端GlcNAc3.5%–26.2%、末端β-Gal11.9%–29.9%；最低CV未集中于同一芯片，说明芯片内点样一致性仍有波动。结果表明原型系统已达半定量所需精密度，但需进一步提升芯片制造与标记均一性以降低变异。

Evaluation of LecChip-IgG-mAb performance with adalimumab biosimilars（阿达木单抗生物类似药的LecChip-IgG-mAb性能评估）：研究人员将优化条件应用于阿达木单抗参比品（3批）与8个生物类似药。1秒曝光下主要信号为末端GlcNAc（最强）、核心岩藻糖（次强）；10秒曝光下末端β-Gal与高甘露糖信号显著增强（约10倍），部分样本可测到低α2,3-唾液酸信号（符合已知CHO来源阿达木单抗含0.1%–1.1% α2,3-NANA）。以参比品均值±3SD（n=15）设接受标准：1秒数据用于核心岩藻糖与末端GlcNAc，10秒数据用于末端β-Gal与高甘露糖。结果所有生物类似药的平均表位信号均在标准内，大部分单个重复也落在区间中，证明该微阵列可有效判别原研药与生物类似药间聚糖表位谱相似性，适合作为可比性评估的补充工具。

讨论部分总结：研究人员指出，传统聚糖分析需酶解释放、标记、色谱分离与MS鉴定，耗时长且需破坏蛋白完整性，而第二代凝集素微阵列可直接在完整抗体上检测聚糖表位，保留Fc天然构象信息，样本量少至1 μg（传统需~15 μg），单芯片可并行14样品（含重复）提升通量；虽需~18小时孵育，但预处理仅~2小时，适合早期开发筛选与生产中聚糖变化监测。微阵列能区分α2,6-与α2,3-唾液酸连接（传统LC-MS常需衍生或离子淌度等附加技术），消逝场荧光检测无需后洗涤即可实时监测，敏感特异。原型9-凝集素阵列基于治疗性抗体9种最常见表位设计，克服了第一代45-凝集素的非特异干扰；验证显示其与MS结果一致，动态范围宽（可达1000 ng/mL，1秒）、中间精密度可控（CV多数<30%）、阿达木单抗原研与类似药表位谱在接受标准内。局限包括信号强度受凝集素亲和影响故仅为半定量、不能区分同表位内精细异构（如GlcNAc在3-arm与6-arm不能分，需串联MS/色谱）、PHAE等有非特异结合需在解读时排除、CV部分源于芯片点样不均与标记波动。未来需采用高质量重组凝集素、优化芯片制造、自动化操作以提高精密度，有望从半定量迈向准定量，拓展至生物类似药可比性研究与工艺中聚糖监测。

结论部分译文：综上所述，本研究证明第二代凝集素微阵列是一个强大、高通量的治疗性抗体半定量聚糖谱分析平台。其能够在完整抗体上分析聚糖并区分连接特异性特征（α2,6-与α2,3-连接的唾液酸），使其成为传统分析方法的优秀补充。经过进一步优化，凝集素微阵列在治疗性抗体开发与质量评估中具有广泛的应用潜力。