《Journal of Applied Phycology》：Bioprospecting for alginate-lyase producing microorganisms for brown seaweed bioprocessing
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酶（Enzyme）在褐藻（Brown Seaweed）生物质环保加工中发挥重要作用，海洋微生物蕴藏着丰富的海藻特异性多糖裂解酶（Polysaccharide-lyase）。针对含海藻酸（Alginate）的褐藻，野生型海藻酸裂解酶（Alginate Lyase
酶（Enzyme）在褐藻（Brown Seaweed）生物质环保加工中发挥重要作用，海洋微生物蕴藏着丰富的海藻特异性多糖裂解酶（Polysaccharide-lyase）。针对含海藻酸（Alginate）的褐藻，野生型海藻酸裂解酶（Alginate Lyase, AL）产生菌可用于海藻酸相关生物加工过程。本研究从环境样品中分离得到8株可分泌胞外AL的微生物，并通过16S rRNA（细菌）及ITS（酵母）测序鉴定至属水平：其中7株为细菌，分别为芽孢杆菌属（Bacillus sp.，4/8）、泛菌属（Pantoea sp.，1/8）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.，1/8）、Stappia sp.（1/8）；1株为红冬孢酵母属（Rhodotorula sp.，1/8）。通过在不同培养基中对分离株进行筛选评估其AL产酶能力，选取Bacillus sp.、Lysinibacillus sp.和Rhodotorula sp.三株菌株进行后续研究，因其显示相对较高的AL活性。此外，研究人员确定了一初步产酶培养基，含两种氮源——蛋白胨（Peptone）与酵母浸粉（Yeast Extract）按5:1比例配制，且为所有测试培养基中盐浓度最高者，该培养基可作为未来类似生物工艺开发的起点。重要的是，本研究分离的Rhodotorula sp.可能是首次报道该属酵母具有AL活性，使其成为未来海带（Kelp）高值化（Valorisation）实践中极具价值的菌株。综上，本研究确认三株微生物可高产AL：两株细菌（广泛用作生物加工菌的Bacillus sp.及较少被研究的Lysinibacillus sp.）和一株具多产物合成潜力的多功能酵母Rhodotorula sp.。
《Bioprospecting for alginate-lyase producing microorganisms for brown seaweed bioprocessing》论文解读
本文发表于《Journal of Applied Phycology》，研究对象为从南非沿海含褐藻生物质及其相关海洋无脊椎动物消化道中分离筛选能分泌胞外海藻酸裂解酶（Alginate Lyase, AL）的野生型微生物，并评估其产酶特性及适宜发酵培养基，为褐藻生物质高值化（Valorisation）——特别是海藻寡糖（Alginate Oligosaccharides, AOs）的酶法制备——提供菌种与工艺基础。
研究背景与立项依据：
褐藻（如南非优势种Ecklonia maxima）是可持续的海洋生物质资源，其细胞壁中海藻酸经AL酶解可得具生物活性的海藻寡糖（AOs），在农、医、药领域具应用潜力。AL主要源自微生物（多为细菌），但现有筛选常采用以海藻酸为唯一碳源的最小培养基（Minimal Medium），限制可培养微生物多样性，且酵母源AL极为罕见。为开发适用于褐藻加工的野生型产AL微生物，研究人员采用多种富集培养基从典型海藻取食/降解相关生境中开展生物勘探（Bioprospecting），并对高产酶菌株及产酶条件进行表征。
主要关键技术方法：
研究人员采集四种环境样品——腐解褐藻（Ecklonia maxima）、沙蚤（Talorchestia capensis）、鲍鱼（Haliotis midae）消化道、海胆（Parechinus angulosus）消化道；采用固体涂布与液体富集两种方式，使用多种成分配比的培养基（含海藻酸为碳源或复合营养源）进行微生物分离纯化；通过碘染平板透明圈法定性筛查胞外AL活性；选用16S rRNA基因PCR测序鉴定细菌至属水平，ITS区域PCR测序鉴定酵母；在不同成分培养基中发酵培养各分离株，取上清以3,5-二硝基水杨酸（Dinitrosalicylic Acid, DNS）法测定还原糖释放量定量AL活力，BCA法测蛋白浓度得比活力；以牛津杯法结合碘染验证水解圈；测定粗酶液在不同pH（pH 4–10，分别用醋酸钠、磷酸钾、甘氨酸-NaOH缓冲液）和温度（20–60 °C）下的相对活性，并进行统计学分析（Shapiro–Wilk正态检验、单因素ANOVA及Tukey HSD事后检验）。
研究结果：
Isolation of microorganisms（微生物的分离）：
研究人员通过富营养化培养基（含蛋白胨和/或酵母浸粉）比最小培养基获得更多形态各异的菌落，表明复合培养基有利于扩大可培养AL产生菌多样性。初筛得到8株具明显水解圈的菌株，经测序鉴定为Bacillus sp.（4株）、Pantoea sp.（1株）、Lysinibacillus sp.（1株）、Stappia sp.（1株）及Rhodotorula sp.（1株酵母）。其中Rhodotorula sp.产AL未见前人报道，系统发育分析显示其与耐极端条件的Rhodotorula frigidialcoholis聚为一支，Lysinibacillus sp.与Lysinibacillus fusiformis聚为一支。
Comparison of crude alginate lyase activity（粗酶液AL活性比较）：
将8株菌在4种含6 g L?1海藻酸的各组培养基（S.1–S.4）中发酵，测定24 h和48 h粗酶比活力（U mg?1蛋白）。Medium S.2〔含蛋白胨与酵母浸粉比5:1，NaCl 30 g L?1，MgCl2·6H2O，KCl〕使Bacillus sp.(1)、Rhodotorula sp.和Lysinibacillus sp.获得最高AL比活力（分别约21.0、18.3、15.7 U mg?1at 24 h），而其余培养基或致某些菌株受抑制。由此选定这三株菌为高效AL产生株，并认定Medium S.2为后续优化的基准培养基。研究指出AL诱导需海藻酸存在，氮源中蛋白胨偏高比例（5:1 peptone:yeast extract）及高盐（尤含Cl?盐）利于产酶，硫酸根与磷酸根可能不利。
Effects of pH and temperature on crude alginate lyase active supernatant（pH和温度对粗AL活性上清液的影响）：
对三株选定金菌株在Medium S.2中发酵所获无细胞上清测定酶学性质。pH实验中，三株菌粗AL均在近中性（pH 6.5–7.5）具最高相对活性，且在pH 4–10较宽范围保持约80–100%相对活性；Lysinibacillus sp.粗酶在pH 4–6出现一次级活性峰，提示可能分泌多型AL。温度实验中，三株粗AL最适温区均为40–50 °C，20–30 °C活性偏低，60 °C显著失活，该中高温适应性有利工业应用。
讨论与结论翻译：
本研究通过对鲍鱼消化道、海胆消化道、沙蚤及腐解Ecklonia maxima褐藻的生物勘探，分离到可产胞外AL的本土微生物。广谱分离技术共获得8株微生物，其中7株为可产胞外AL的细菌，1株为可分泌胞外AL的红冬孢酵母属（Rhodotorula sp.，1/8）。分离株在各文献培养基中培养以比较AL产量并确定最佳产酶配方。最终，Bacillus sp.(1)、Rhodotorula sp.及Lysinibacillus sp.据Medium S.2中AL产量被遴选为高潜力AL产生株，适用于褐藻相关应用。此外，这三株菌均偏好高盐培养基（本研究中定为Medium S.2；表2），含复合氮源（蛋白胨与酵母浸粉）及所试培养基中最高的盐浓度。随后评估各菌株产AL活性上清液中pH与温度的影响。各菌株AL活性上清液对多变pH与温度条件显示良好耐受性，使这些分离株成为进一步探究其海藻酸利用策略的有用候选者。此外，本研究获得一株具产AL潜力的Rhodotorula sp.，系首次报道该属具显著AL产出能力，该菌株可作为今后将特异AL相关基因克隆至重组宿主的供体菌。
