《Frontiers in Veterinary Science》：Investigation of carbohydrate-based molecules of Theileria parva parasites
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泰勒氏原虫（Theileria parva， Tp）是东海岸热（East Coast Fever）的病原体，对撒哈拉以南非洲地区的牛（Bos taurus）构成重大威胁。由于对覆盖多种主要组织相容性复合体（MHC）呈递的Tp抗原的稳定、经济、交叉保护性亚单位疫
泰勒氏原虫（Theileria parva， Tp）是东海岸热（East Coast Fever）的病原体，对撒哈拉以南非洲地区的牛（Bos taurus）构成重大威胁。由于对覆盖多种主要组织相容性复合体（MHC）呈递的Tp抗原的稳定、经济、交叉保护性亚单位疫苗的研发进展，受到抗原知识有限的阻碍。鉴于糖缀合物（glycoconjugates）在原生动物病原体生物学中的重要性，尤其是在入侵过程中，研究人员研究了Tp的糖基化潜能。使用C型凝集素（样）受体（C-type lectin (-like) receptor）对Tp Muguga（TpM）裂殖体（schizonts）的筛选表明，反刍动物（而非鼠类）的巨噬细胞C型凝集素（Macrophage C-type Lectin， MCL）能识别该寄生虫。反刍动物MCL与TpM裂殖体的结合，提示了寄生虫表面存在与碳水化合物相关的分子。凝集素染色进一步提示，寄生虫表面存在末端N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）残基，这与在TpM裂殖体中鉴定出最小N-糖基化（N-glycosylation）机制的结果一致。对来自寄生虫蛋白组分的亲水相互作用液相色谱（HILIC）高效液相色谱和凝集素富集的肽段进行LC-MS/MS分析，鉴定出8个预测的N-糖肽（N-glycopeptides）和2个预测的O-糖肽（O-glycopeptides）。推定的寄生虫O-聚糖（O-glycans）被高置信度地分配，但推定的N-聚糖（N-glycans）分配到寄生虫蛋白的置信度较低。本数据为潜在的TpM糖缀合物提供了初步见解，同时聚糖组成和分配的确认需要进一步分析。
**论文解读：泰勒氏原虫（Theileria parva）糖基化潜能的初步研究**
**1. 研究背景与问题**
东海岸热（ECF）是由蝉传播的顶复门寄生虫——泰勒氏原虫（Theileria parva， Tp）引起的严重牛类疾病，对撒哈拉以南非洲地区的畜牧业构成重大威胁。该病具有高发病率和死亡率，主要影响牛（Bos taurus），给当地牧民尤其是小型养殖户带来巨大经济负担。Tp的子孢子通过感染蝉的唾液腺释放并侵入牛淋巴细胞，发育为裂殖体。裂殖体转化并与宿主细胞共同增殖，导致淋巴细胞失控性增生和迁移，最终引发组织细胞性炎症免疫反应，常导致患病动物出现肺水肿和呼吸衰竭。
当前ECF是可预防的，但现有策略存在问题。频繁使用杀螨剂控制蝉虫不仅对环境造成负面影响，还促进了蝉群的抗药性。现有的“疫苗策略”——感染与治疗法（ITM），涉及接种活Tp子孢子并联合使用长效土霉素，但其生产过程费时费力且昂贵，疫苗稳定剂需要持续的冷链，且诱导的免疫反应交叉保护性有限。免疫保护作用主要由主要组织相容性复合体（MHC）I类限制性的、针对裂殖体感染淋巴细胞的细胞毒性CD8
+ T细胞反应介导。然而，不同个体牛的保护性CD8
+ T细胞仅识别少数几个主要寄生虫抗原，这限制了针对不同Tp菌株的交叉保护。因此，开展此项研究旨在探索TpM的糖基化潜能，鉴定潜在的糖蛋白，以期为发展ECF交叉保护性亚单位疫苗提供支持。
**2. 主要关键技术与方法**
本研究主要采用了以下技术方法：
* **细胞与寄生虫培养**：建立Tp Muguga（TpM）裂殖体感染的细胞系。感染源为体外从牛外周血单核细胞（PBMCs，来源于新鲜冷冻样本）与TpM子孢子（来自研磨的蝉稳定剂，GUTS，批次S71）共培养。
* **裂殖体富集**：通过诺考达唑（nocodazole）处理、机械裂解宿主细胞，并结合Nycodenz密度梯度离心法从感染的B细胞系中富集TpM裂殖体。
* **凝集素阵列与流式细胞术筛选**：利用重组牛C型凝集素（样）受体（CLR）阵列及多种C型凝集素受体（CLR）-人Fc（hFc）融合蛋白（如Dectin-1, Dectin-2, MCL, MICL, Mincle, Langerin, DNGR, DCIR）对富集的TpM裂殖体进行流式细胞术筛选。同时，使用植物凝集素小麦胚芽凝集素（WGA）和伴刀豆球蛋白A（ConA）进行凝集素结合抑制试验。
* **蛋白质组学分析**：制备TpM裂殖体全蛋白裂解液，通过Triton X-114相分离获得亲水相（AP）和去垢剂富集相（DP）蛋白。随后进行西方印迹（Western blot）分析及质谱（MS）分析。
* **糖肽富集与鉴定**：对酶切后的肽段进行亲水相互作用液相色谱（HILIC）分离和基于WGA的凝集素亲和层析（LAC）富集糖肽，再通过高分辨液质联用技术（nanoLC-ESI-MS/MS）进行鉴定。利用FragPipe软件（v22.0）结合Byonic聚糖数据库进行糖基化位点和聚糖组成的分析。
**3. 研究结果**
* **反刍动物MCL识别TpM裂殖体表面分子**：通过牛凝集素受体阵列和CLR-hFc融合蛋白的流式细胞术筛选，发现反刍动物（绵羊和牛）的巨噬细胞C型凝集素（MCL）特异性识别富集的TpM裂殖体，而鼠源MCL无此结合。该结果表明TpM寄生虫表面存在碳水化合物相关的分子，且与TpM对反刍动物的宿主特异性相符。
* **WGA结合实验表明存在N-糖蛋白**：使用WGA对TpM裂殖体进行流式细胞术分析，发现WGA可结合寄生虫，且这种结合可被其配体N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）以剂量依赖性方式抑制，表明TpM表面存在GlcNAc残基。相比之下，ConA的结合未被其配体α-甲基甘露糖苷抑制。随后对TpM蛋白提取物的西方印迹分析显示，WGA结合的分子主要集中在70-250 kDa的AP和DP组分中，且经PNGase F去N-糖基化处理后信号几乎消失，证实这些WGA结合分子是N-连接的糖蛋白。
* **抗体检测提示存在O-GlcNAc化蛋白**：利用抗O-GlcNAc单克隆抗体进行流式细胞术检测，发现仅约4%-5%的寄生虫表面被标记，表明细胞表面O-GlcNAc修饰水平较低。然而，西方印迹分析显示该抗体识别TpM裂殖体蛋白提取物中的多种蛋白，尤其是在AP组分中，且在感染淋巴细胞中呈现出不同的染色模式，提示TpM裂殖体中可能存在胞内蛋白发生O-GlcNAc修饰。
* **LC-MS/MS鉴定出少量寄生虫糖肽**：对富集的TpM裂殖体蛋白组分的LC-MS/MS分析，在同时搜索T. parva和B. taurus蛋白数据库后，鉴定出大量来源于宿主的糖蛋白。但研究人员仍鉴定出8个推测为N-糖基化的寄生虫肽段和2个推测为O-糖基化的肽段。这些寄生虫N-糖肽携带的聚糖类型多样，包括寡甘露糖型、岩藻糖化和唾液酸化的复杂型聚糖，但未检测到预测的截短型N-聚糖（HexNAc
1-2）。两个O-糖肽携带的聚糖推测为粘蛋白型O-聚糖。然而，由于鉴定的数量少、部分聚糖分配置信度较低（高q值）以及大多数推测N-糖蛋白缺乏信号肽和跨膜结构域，这些发现需要进一步的验证。
**4. 讨论与结论**
本研究旨在探讨TpM的糖基化潜力。结果发现，反刍动物（非鼠类）的MCL能识别TpM裂殖体，且该识别可能由表面糖缀合物介导。WGA和ConA结合实验进一步提示寄生虫表面糖基可能含有GlcNAc而非甘露糖。这与TpM裂殖体中仅存在一个最小N-糖基化机制（可能只生成带有1-2个GlcNAc的糖脂）相悖，且因未检测到OST基因同源物，使得N-糖蛋白的存在与否成为研究的焦点。
讨论部分指出，除糖蛋白外，糖脂也可能被凝集素（如MCL、MICL、Mincle）识别。MICL能结合TpM裂殖体，但其配体范围宽泛（包括晶体分子），故本研究未深入探讨。尽管TpM的N-糖基化基因不完整，但蛋白质分析结果仍提示存在N-糖蛋白和O-GlcNAc化蛋白。然而，裂殖体富集方法易受宿主糖缀合物污染，LC-MS/MS结果确认了宿主来源肽段的存在。通过HILIC-HPLC和WGA富集后的LC-MS/MS分析，虽然鉴定了预测的8个N-糖肽和2个O-糖肽，但其聚糖组成的意外多样性、较高的q值以及大多数推测N-糖蛋白缺乏信号肽的情况，均表明需要进行额外研究。相对而言，一个O-糖蛋白的聚糖分配具有较低的FDR。
研究结论：本研究通过对TpM裂殖体进行凝集素筛选和糖蛋白组学分析，首次揭示了TpM可能表达N-和O-连接的糖蛋白。研究发现反刍动物MCL能识别TpM，植物凝集素WGA和ConA的结合提示了表面GlcNAc残基的存在。同时，质谱分析鉴定了少量推测为TpM来源的糖肽。这些数据为TpM潜在的糖缀合物提供了初步见解，但其聚糖组成和糖蛋白身份的确认需要进一步分析，尤其是在其他Tp菌株中。
