白鹭促进携带质粒介导粘菌素(colistin)耐药基因 mcr-1 的大肠埃希菌(Escherichia coli)菌株在朱鹮(Nipponia nippon)中的传播与扩散

《Transboundary and Emerging Diseases》：Egrets Promote the Transmission and Spread of Plasmid-Mediated Colistin Resistance Gene mcr-1-Bearing Escherichia coli Strains in Crested Ibis

　　

由于质粒介导的可转移性，粘菌素(colistin)耐药基因尤其是 mcr-1 基因在全球受到日益广泛的关注。为阐明濒危物种朱鹮(Nipponia nippon)及其养殖环境中粘菌素耐药基因的传递动力学，研究人员于 2017—2024 年在中国浙江德清朱鹮人工繁育中心开展 mcr-1 监测，并采用全基因组测序分析携带该耐药基因肠杆菌科(Enterobacteriaceae)分离株间的系统发育关系。共季节性采集朱鹮粪便标本 2660 份，仅发现一次 mcr-1 检出事件，共分离到 144 株 mcr-1 阳性菌株；其中 2021 年 4 月首次检出率为 8%，7 月升至 25%，10 月回落至 10.6%。此外，野生白鹭(egret)粪便（33%）、工作人员所养犬只粪便（8.3%）及排放污水中亦检出携带 mcr-1 的大肠埃希菌(Escherichia coli)，但工作人员粪便、泥鳅肠道内容物及饮水源中未检出。系统发育分析显示，白鹭来源分离株 BLM86 与朱鹮来源分离株 ZHM12 同属 ST58?cgST28300 型，且核心基因组单核苷酸多态性(SNP)无差异。经深入分析的 36 株 mcr-1 阳性分离株均呈多重耐药(multidrug resistance, MDR)，所携带 mcr-1 质粒可分为 4 种不相容(incompatibility, Inc)型：IncI2（20/36，55.6%）、IncX4（19.4%）、IncP1（11.1%）和 IncHI2（13.9%）。系统发育分析提示部分朱鹮源分离株与白鹭源分离株亲缘关系密切，暗示二者间存在潜在环境传播路径。实施生物安全干预措施后，朱鹮种群中不再检出 mcr-1。研究结果表明，野生白鹭可作为将含 mcr-1 大肠埃希菌引入圈养朱鹮群体的潜在媒介(vectors)，凸显了在抗菌药耐药性(antimicrobial resistance, AMR)防控中设置种间屏障的重要性。

本研究发表于《Transboundary and Emerging Diseases》。

【研究背景与意义】

粘菌素(colistin)作为治疗多重耐药(multidrug resistance, MDR)革兰氏阴性菌感染的最后一线药物，其有效性因质粒介导 mcr-1 基因在全球人、动物及环境中的广泛播散而受到严重威胁。野生动物尤其野生水鸟可自污染生境获得抗菌药耐药菌(antibiotic?resistant bacteria, ARB)并沿迁徙路线扩散，构成 One Health 框架下尚未被充分认知的耐药基因传播风险。朱鹮(Nipponia nippon)为 IUCN 红色名录濒危物种，人工圈养种群若引入 MDR 菌株将危及个体健康与再引入工程。虽然 mcr-1 已在多种野生鸟类中被检出，但其于鸟类—人—共栖动物间的确切传播机制尚不清楚。为此，研究人员以浙江德清朱鹮繁育中心这一半封闭生态系统为对象，假设野生白鹭可将外源性 mcr-1 带入该系统，开展长期监测、全基因组溯源及干预效果评估，以明确跨宿主传播路径，为濒危物种栖息地抗菌药耐药性(antimicrobial resistance, AMR)防控提供依据。

【主要关键技术方法】

研究人员于 2017—2024 年对浙江德清朱鹮繁育中心开展纵向监测，样本队列涵盖圈养朱鹮季节性粪便(n=2660)、野生白鹭粪便、饲养员粪便、家养犬粪便、主饲料泥鳅(Misgurnus spp.)肠道内容物、朱鹮饮水槽水样及圈舍排放污水；分离培养后采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)筛查 mcr-1 基因。选取 36 株代表性 mcr-1 阳性分离株进行全基因组测序(whole?genome sequencing, WGS)，借助 Center for Genomic Epidemiology(CGE)平台完成多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)与核心基因组多位点序列分型(core?genome MLST, cgMLST)、耐药基因及毒力因子注释、质粒不相容型(Inc type)判定；采用 Harvest 套件构建基于核心基因组单核苷酸多态性(core?genome SNP, cgSNP)的最大似然法系统发育树，并从 NCBI 下载 99 株已发表 mcr-1 阳性大肠埃希菌(Escherichia coli)序列作比较进化分析；药敏试验分别按 EUCAST 肉汤微量稀释法测粘菌素最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)及 CLSI 标准 K?B 纸片扩散法测 14 种抗菌药物敏感性；采取 χ2 或 Fisher 精确检验进行率比较，Bonferroni 校正，p＜0.05 为差异有统计学意义。干预措施包括加强含氯消毒、笼舍周边加装防鸟网阻隔白鹭、人员进出更衣鞋底消毒及清除白鹭粪便。

【研究结果】

3.1. Prevalence of Colistin Resistance Gene mcr?1 in Crested Ibis（朱鹮中粘菌素耐药基因 mcr?1 的流行情况）

2017—2024 年纵向监测显示，朱鹮粪便中 mcr?1 仅于 2021 年 4 月首现（8%，8/100），7 月升至峰值 25%（17/68，p＝0.04 vs 4 月），10 月降至 10.6%（9/85），2022 年 1—7 月均为阴性。同期横断面调查表明，白鹭粪便 mcr?1 阳性率 33%（7/21），家养犬 8.3%（1/12），排放污水 7 月 40%、10 月 52.4%；饲养员粪便、泥鳅及饮水均未检出。实施针对白鹭阻隔及强化消毒等干预后，朱鹮群体内 mcr?1 转阴，但 2022 年 7 月白鹭及原饲养员家属粪便仍可检出，提示白鹭是很可能的 mcr?1 传入媒介。

3.2. Genomic Epidemiology of mcr?1?Positive Isolates（mcr?1 阳性分离株的基因组流行病学）

36 株 mcr?1 阳性分离株（朱鹮 21、人 1、犬 6、白鹭 8；35 株大肠埃希菌＋1 株 Fergusonii 埃希菌 Escherichia fergusonii）经 WGS 鉴定出 17 种 ST 型，优势为 ST155(n=7)、ST69(n=3)、ST744(n=3)、ST906(n=3)、ST6753(n=3)；cgMLST 划分 20 个 cgST 型。系统发育分析识别出 5 个遗传谱系(C1—C5)，C1 最常见含多宿主分离株；关键证据为白鹭分离株 BLM86 与朱鹮分离株 ZHM12 同属 ST58?cgST28300，核心基因组 SNP 差异为零，证实跨宿主密切遗传关联。ClermonTyping 显示系统群(phylogroup) B1 为主(n=20)，广泛存在于各宿主。

3.3. AMR Analysis of mcr?1?Positive Isolates（mcr?1 阳性分离株的抗菌药物耐药性分析）

36 株均表现为 MDR，对新霉素(neomycin)、头孢拉定(cefradine)、多黏菌素 B(polymyxin B)及四环素(tetracycline) 100% 耐药；其他较高耐药率包括羧苄西林 83.3%、氨苄西林 80.6%、环丙沙星 86.1%、氯霉素与氟苯尼考各 75%、卡那霉素 50% 等。耐药表型与相关耐药基因吻合——tet(A) 对应四环素耐药，bla_TEM?1B与 bla_CTX?M变异体对应 β?内酰胺类耐药，qnrS1 及氨基糖苷类修饰酶基因(aph、aac)分别对应喹诺酮与氨基糖苷耐药。

3.4. Genomic Characteristics of mcr?1?Positive Isolates（mcr?1 阳性分离株的基因组特征）

WGS 注释发现所有分离株均携带四环素、利福平、喹诺酮、多黏菌素、酰胺醇及氨基糖苷类耐药基因；97.2% 含 E. coli 多药外排泵编码基因 mdf(A)。半数以上检出 tet(A)、floR、aph(3')?Ib、aph(6)?Id、sul1/sul2、qnrS1、dfrA14 等；77.8% 至少携带一种 β?内酰胺酶基因(bla_TEM、bla_CTX?M、bla_DHA、bla_OXA、bla_IAP)，未检出碳青霉烯酶基因。毒力因子预测显示黏附、效应物递送及营养代谢相关基因丰富；细胞毒素(cdtABC、usp)仅见于两株朱鹮源菌；毒力基因数目与耐药基因数目呈负相关(r＝?0.371，p＜0.01)。

3.5. Genetic Background of the Plasmids Harboring mcr?1（携带 mcr?1 质粒的遗传背景）

mcr?1 主要位于 IncI2(55.6%)、IncX4(19.4%)、IncHI2(13.9%) 及 IncP1(11.1%) 质粒。IncI2 型与首株猪源 mcr?1 质粒 pHNSHP45(KP347127.1) 侧翼区＞99% 一致，但缺失 ISApI1，部分株嵌有 ISSen6 或 ISEc9；IncX4 型与 pMCR?NMG38(MK836307.1) 高度同源，部分株 mcr?1 上游约 3 kb 处带 IS26；IncP1 仅见于朱鹮源株，骨架近似 pEF5?18?41_3(CP063495.1)，部分 mcr?1 两侧伴 ISApI1；IncHI2 型见于朱鹮与犬源株，无插入序列或其他耐药基因。上述四种质粒共同参与 mcr?1 在生境中的水平转移。

3.6. Associations Among the Isolates of Different Origins（不同来源分离株间的关联）

联合 NCBI 下载的 99 株异源 mcr?1 阳性 E. coli 构建核心基因组 SNP 系统发育树显示，同种宿主/地区株多聚簇，但本研究朱鹮源株(21 株)分布于 4 个分支，其中 61.9%(13/21) 集中于含白鹭、人、犬分离株的混合分支(C2)，提示 mcr?1 阳性 E. coli 具备跨动物—环境—人储库的广泛播散潜力，可形成动物—环境—人闭环传播。

【讨论与结论总结】

讨论指出，野生水鸟可借觅食与集群从污染生境获取并沿迁徙扩散抗菌药耐药基因(antibiotic resistance genes, ARGs)。本研究中 mcr?1 于 2021 年短暂暴发起伏并于白鹭管控措施实施后半年内自朱鹮群消失，印证白鹭为重要传入媒介；系统发育证实白鹭与朱鹮共有零 SNP 差异 ST58?cgST28300 克隆及多宿主共享 ST155 等型别，支持动物—环境—人闭环传播模式。IncI2 质粒在本研究 mcr?1 载体中占比最高且在无粘菌素选择压下相对稳定，利于环境水平转移；部分 mcr?1 质粒在无抗生素压力下可自然丢失，这与干预后朱鹮群转阴相符。局限在于白鹭受迁徙影响未能做匹配季节性连续监测，且 4 mg/L 粘菌素筛选浓度可能低估低 MIC 携带株。

结论(Conclusion)翻译：综上所述，本研究记录了濒危圈养朱鹮种群中质粒介导粘菌素耐药基因 mcr?1 的时限性散发流行。整合基因组与流行病学证据显示，野生白鹭是将含 mcr?1 大肠埃希菌(Escherichia coli)引入圈养朱鹮群体的关键媒介(vectors)。针对性生物安全干预后 mcr?1 成功自朱鹮种群清除，证实了此类措施的有效性与可行性。研究结果强调，应将野生动物耐药基因监测纳入 AMR 防控策略，采取 One Health 理念以保护共有生态系统中的脆弱物种。