一种靶向p72的快速非洲猪瘟病毒胶体金免疫层析试纸条

《Transboundary and Emerging Diseases》：A Rapid p72-Targeting Colloidal Gold Immunochromatographic Strip for African Swine Fever Virus Detection

　　

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种致死性、出血性、高度接触性传染病。目前，ASFV已在中国演化出多种毒力水平的变异株，使流行病学形势日趋复杂。在缺乏有效商业化疫苗的背景下，开发快速、准确的诊断方法成为防控重点。本研究通过灭活的ASFV免疫小鼠制备单克隆抗体（mAb），筛选出9株靶向p72蛋白的新mAb，并结合实验室前期已有的11株抗p72 mAb，建立用于ASFV检测的胶体金免疫层析试纸条。通过交叉配对分析确定最优抗体组合：ASFV-3为胶体金标记抗体，P72-6为捕获抗体。该试纸条可有效检测不同基因型ASFV，对基因Ⅰ型和Ⅱ型的检测限（LOD）分别为102.50TCID50/反应和相应水平，与五种常见猪病原（PCV、PRRSV、PRV、PEDV、TGEV）无交叉反应，与市售试纸条符合率达93.33%。研究表明，研究人员成功开发了一种快速、灵敏、特异的靶向ASFV p72蛋白的胶体金免疫层析试纸条，操作简便、无需专用设备，适用于现场检测，为ASF田间监测与早期诊断提供了实用工具。

论文解读：一种靶向p72的快速非洲猪瘟病毒胶体金免疫层析试纸条

研究背景与意义

非洲猪瘟（African Swine Fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus, ASFV）引起的一种高度致死性、急性出血性传染病，主要感染家猪和野猪，对全球养猪业构成重大威胁。ASFV目前无安全有效的商业化疫苗和抗病毒药物，防控依赖严格的生物安全与精准的扑杀策略。自2018年传入中国以来，ASFV已演化出基因Ⅱ型强毒株、中等毒力株、基因Ⅰ型低毒力株及Ⅰ/Ⅱ重组株，流行态势复杂化。虽然实时荧光定量PCR（qPCR）是公认的核酸确诊金标准，但其依赖精密仪器与专业人员，难以适应养殖场、屠宰场及边境口岸等现场快速初筛需求。因此，开发无需设备、操作简便、灵敏度与特异性俱佳的现场抗原检测技术具有重要现实意义。p72蛋白由B646L基因编码，是ASFV主要衣壳蛋白，占病毒粒子总质量约33%，以三聚体形式暴露于病毒表面，各流行株间高度保守且免疫原性强，是诊断与疫苗设计的理想靶标。基于此，研究人员以p72为靶标，通过制备新型单克隆抗体（mAb）并优化抗体配对，构建了胶体金免疫层析试纸条（Colloidal Gold Immunochromatographic Strip, CG-ICS），旨在提供一种适合现场使用的ASF快速抗原检测工具。本论文发表于《Transboundary and Emerging Diseases》。

主要关键技术方法概述

研究人员采用灭活全病毒免疫SPF BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，并利用间接免疫荧光（IFA）、Western blot及间接ELISA（iELISA）鉴定其靶标为p72或p30蛋白。以天然三聚体p72蛋白及前期实验室保存的11株抗p72 mAb为库，通过大量交叉配对实验筛选层析最优组合。胶体金颗粒（约40 nm）通过晶种生长法制备，表征后与优选检测抗体偶联，优化pH与用量；在硝酸纤维素（NC）膜上分别包被捕获抗体与羊抗鼠IgG作为T线（检测线）与C线（质控线），组装样品垫、结合垫、NC膜与吸水垫于PVC背板。研究人员以ASFV基因Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅰ/Ⅱ重组株为模型，通过系列稀释测定检测限（LOD）；以PCV、PRRSV、PRV、PEDV、TGEV等常见猪病原评价特异性；通过多批次、多重复临床样本（口腔/肛门拭子、组织匀浆）对比qPCR与市售试纸条，评估重现性与临床符合率；部分抗体亲和力通过表面等离子共振（SPR）分析。临床样本来源于HLJ/18株感染SPF猪的纵向监测及健康对照。

研究结果

3.1 动物免疫与抗原制备

研究人员以β-丙内酯灭活ASFV HLJ/18-7GD株免疫小鼠，通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒，电镜确认完整病毒颗粒。免疫后血清iELISA显示强抗p72应答，选取效价最高的5号小鼠进行细胞融合。

3.2 单克隆抗体制备与鉴定

融合筛选获得15株杂交瘤，IFA均显示感染细胞特异性荧光。Western blot显示14株识别感染细胞裂解物，其中9株靶向p72（B646L），5株靶向p30（CP204L），1株（ASFV-9）靶标未明。亚型分析显示轻链均为κ型，重链涵盖IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。部分抗p72 mAb在天然与变性条件下识别略有差异，反映表位构象特征。

3.3 p72基免疫层析试纸条的建立

研究人员将新制备的全病毒源抗p72 mAb与实验室原有p72三聚体免疫源mAb库进行交叉配对（捕获-检测组合筛查）。通过可视化T线信号强度评估，最终确定ASFV-3（全病毒源，IgG2a）为胶体金标记检测抗体，P72-6（重组p72三聚体源，IgG1）为NC膜捕获抗体。SPR显示ASFV-3亲和常数为4.32×10^?9M，P72-6为2.61×10^?8M。胶体金粒径约43.6 nm（PDI 0.097），偶联效率90.8%±1.2%。优化后条件：标记pH 7.5，ASFV-3 20 μg/mL，T线P72-6 1.5 mg/mL，C线羊抗鼠IgG 2.0 mg/mL。试纸条判读规则：C线与T线均显色为阳性，仅C线为阴性，C线不显色为无效。

3.4 SPR亲和力测定

研究人员以重组p72蛋白为配体，测定5株表现优良抗体的动力学。ASFV-3具最高亲和力（ka=1.69×10⁵M^?1s^?1，kd=7.29×10^?4s^?1），适合液相快捕；P72-6解离稍快（kd=1.11×10^?2s^?1），适合固相稳定捕获，与功能分工一致。

3.5 特异性评估

以高滴度PCV-2d、PRRSV HuN4、PRV HeN1、PEDV LN-NY、TGEV JMS及ASFV HLJ/HRB1/20测试，仅ASFV样本出现T+C双线，其余病原仅C线，表明试纸条对ASFV高度特异，无交叉反应。

3.6 敏感性评估

对HLJ/HRB1/20（基因Ⅱ）、SD/DY-Ⅰ/21（基因Ⅰ）、JS/LG/21（重组Ⅰ/Ⅱ）进行10倍系列稀释，三次独立重复检测限分别为10^2.50、10^2.42、10^2.30TCID₅₀/反应，综合LOD定义为10^2.50TCID₅₀/反应。同期市售试纸条对HLJ/HRB1/20的LOD为10^4.20TCID₅₀/反应，新建试纸条灵敏度约提升50倍；对应稀释下qPCR均为阳性（Ct 31–34）。

3.7 重现性测试

选取qPCR阳性临床样本P1–P5与阴性N1–N5，用三批次试纸条各重复3次。结果显示所有阳性样本均3/3阳性，阴性样本均0/3阳性，批内与批间一致，表明试纸条具良好重现性。

3.8 临床样本检测

以HLJ/18感染SPF猪的口腔/肛门拭子（3、5、7、9 dpi）及组织（脾、肺、扁桃体、下颌及肠系膜淋巴结等）共90份样本，并行qPCR、新建试纸条与市售试纸条检测。与市售试纸条比，总符合率93.33%（46一致阳性，38一致阴性，6例新建阳性而市售阴性，无假阳）。临床敏感性100.00%，特异性88.36%。动态监测中，新建试纸条在5 dpi肛门拭子即检出1例阳性，而市售试纸条多从7 dpi起检出，提示更早检出的潜力。

讨论与结论总结

研究人员在讨论中指出，全病毒免疫筛选的mAb更易识别天然构象表位，适合作为液相“捕捉手”；重组蛋白免疫的mAb稳定性好，适合作为固相“陷阱”，这种“全病毒源快捕+重组蛋白源稳捕”的配对策略可协同提升敏感与特异。本研究建立的抗体库涵盖多种IgG亚型，其中ASFV-3（IgG2a）高亲和力、快结合，P72-6（IgG1）稳定固相捕获，最优配对兼顾层析动力学与信号稳定性。SPR以重组p72替代完整病毒颗粒测定亲和力，避免了大颗粒病毒的质量传输限制，数据（χ²<0.5）与1:1 Langmuir模型吻合，且试纸条对完整病毒的实测LOD验证了其可靠性。该试纸条对国内主流流行株（基因Ⅰ、Ⅱ及重组株）均有效，分析31条2022–2026年p72序列发现国内流行株存在S126A、V376I、A383P变异，但所检三株均携带这些突变且被测抗体仍有效；香港株R392H未实验验证，未来需持续监测p72表位变异对免疫诊断的影响。相比qPCR，胶体金法灵敏度仍有差距，极低病毒载量可能漏检，长期稳定性与便携式读数定量是未来方向。

研究结论翻译

综上所述，研究人员设计了一种基于ASFV p72蛋白单克隆抗体的胶体金免疫层析检测方法，与市售胶体金检测试纸条相比具有良好的特异性、敏感性和准确性。此外，该方法操作简便，无需复杂样品前处理，适用于ASFV的现场快速初筛。