《Transboundary and Emerging Diseases》：Identification and Genome Phylogenetic Analysis of Three Brucella abortus Strains From Sheep, Yak, and Cow in Qinghai, China
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尽管布鲁氏菌病在青藏高原（Qinghai–Tibet Plateau）呈地方性流行，但该地区循环传播的流产布鲁氏菌（Brucella abortus）的分子流行病学特征仍缺乏充分解析。因此，本研究采用细菌学与全基因组测序（whole-genome sequen
尽管布鲁氏菌病在青藏高原（Qinghai–Tibet Plateau）呈地方性流行，但该地区循环传播的流产布鲁氏菌（Brucella abortus）的分子流行病学特征仍缺乏充分解析。因此，本研究采用细菌学与全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）相结合的综合策略，对中国青海省绵羊、牦牛和牛源流产布鲁氏菌分离株进行遗传学表征。常规生物分型试验和多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）结果显示，3株菌被明确鉴定为流产布鲁氏菌1生物型、序列型2（ST2）。进一步地，平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）分析表明，3株菌（BA0611、BAHYS和BAQHM）之间的ANI值均高于99.99%，且与流产布鲁氏菌参考株的一致性均超过99.91%，从而证实了其物种归属。3株流产布鲁氏菌分离株BA0611、BAHYS和BAQHM表现出完全一致的毒力基因谱，共携带69个毒力相关基因，并一致缺失3个关键毒力相关基因，即bmaA、btpB和virB10。核心基因组单核苷酸多态性（core-genome SNP，cgSNP）系统发育分析揭示，这3株菌与西藏菌株XZ19-1及俄罗斯分离株具有较近的遗传亲缘关系，并可与此前鉴定的本地人源和旱獭源菌株区分开来。3株菌之间观察到的高度遗传相似性提示其感染来源共同，支持将这些病例归类为聚集性感染。上述数据共同证实，青藏高原存在遗传上分化的流产布鲁氏菌谱系，这丰富了当前对该地区这一人兽共患病原体宿主谱及基因组多样性的认识。这些发现为优化地方基因组监测和制定精准防控策略提供了有力支持，有助于降低动物和人群中的布鲁氏菌病流行水平。
该研究发表于《Transboundary and Emerging Diseases》，围绕青海地区不同家畜宿主来源流产布鲁氏菌（Brucella abortus）的分离鉴定、基因组特征与传播线索展开，旨在弥补青藏高原流产布鲁氏菌分子流行病学证据不足的问题。布鲁氏菌病是重要的人兽共患病，在全球范围内危害公共卫生与畜牧业生产。青海地处青藏高原腹地，属于典型的牧业与半牧业地区，布鲁氏菌病长期流行，且近年人间病例明显上升。既往研究已证明当地至少存在羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）、流产布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌（Brucella suis）等多种布鲁氏菌，其中羊种布鲁氏菌报道较多，而流产布鲁氏菌虽持续存在于动物宿主中，却缺乏来自多宿主、尤其是主要家畜宿主的系统性基因组分析资料。与此同时，青藏高原地区家畜、野生动物与人群之间存在复杂接触网络，既往还曾从当地旱獭和患者中分离到流产布鲁氏菌，提示该病原可能在多宿主系统中持续传播。因此，研究人员开展本研究，目的是从家畜层面补充关键基因组证据，解析其宿主分布、遗传保守性、系统发育位置及潜在传播关系，为区域精准防控提供基础。
在研究设计上，研究人员于2015—2016年采集青海流产绵羊胎儿脾脏样本11份、牦牛流产胎儿脾脏样本19份和牛流产胎儿脾脏样本10份，进行细菌分离培养；随后通过BSCP-31 PCR、AMOS-PCR和常规生物分型完成菌种与生物型鉴定；对获得的分离株实施全基因组测序（WGS）、de novo组装、基因注释、平均核苷酸一致性（ANI）分析、泛基因组分析、毒力与耐药相关基因比对；并结合体外多位点序列分型（MLST）和基于550株流产布鲁氏菌公开基因组的核心基因组单核苷酸多态性（cgSNP）最大似然系统发育分析，比较其与国内外菌株的亲缘关系。
研究总体表明，来自绵羊、牦牛和牛的3株分离株均属于流产布鲁氏菌1生物型、ST2型，彼此之间高度同源，并具有一致的毒力基因构成和稳定的基因组框架；在系统发育上，这3株菌与西藏及俄罗斯相关菌株关系更近，而不同于此前报道的本地人源和旱獭源菌株。该结果提示青藏高原同时存在多个遗传上可分辨的流产布鲁氏菌亚群，多宿主传播生态复杂，且本研究涉及的3株家畜源菌株很可能代表一次共同来源的聚集性传播事件。此项研究的重要意义在于首次从青海高原主要家畜宿主角度提供了流产布鲁氏菌的基因组证据，拓展了该菌在区域内的宿主谱认知，并为One Health（同一健康）框架下的跨宿主监测、病原溯源和风险防控提供了遗传学支撑。
就主要技术方法而言，研究人员首先对青海家畜流产胎儿脾脏样本进行病原分离培养，并以属特异性PCR、生物型特异AMOS-PCR及传统表型分型相结合完成初筛与鉴定；随后对纯化菌株实施全基因组测序（WGS）、基因组组装与注释，并通过平均核苷酸一致性（ANI）和泛基因组分析评估种属归属与基因组保守性；在群体遗传层面，研究结合多位点序列分型（MLST）和基于公共数据库550株基因组的核心基因组SNP（cgSNP）系统发育推断，解析菌株谱系归属和区域传播关系。
在“3.1. Species Identification and ANI Analysis of B. abortus Strains”部分，研究人员首先通过分子生物学和表型学双重证据确认物种身份。BSCP-31 PCR扩增出223 bp条带，证实分离株属于布鲁氏菌属；AMOS-PCR获得498 bp特异片段，符合流产布鲁氏菌1、2、4生物型的特征，其中结合常规生物分型结果，最终将3株菌鉴定为流产布鲁氏菌1生物型。随后进行ANI分析，结果显示BA0611、BAHYS和BAQHM三株之间ANI值超过99.99%，提示三者基因组几乎完全一致；同时与流产布鲁氏菌参考株的一致性均高于99.91%，而与其他经典布鲁氏菌物种参考株的一致性相对更低。这一结果从全基因组水平进一步稳固了其物种归属，也提示3株菌具有非常接近的遗传背景。
在“3.2. Genome Features and Pan-Genomic Analysis of B. abortus Strains”部分，研究人员分析了3株菌的基因组装特征和泛基因组结构。结果显示，各株组装质量较高，scaffold数为18–22个，N50为297,696–383,549 bp，总基因组大小稳定在约3.26–3.27 Mb，GC含量为55.3%–56.1%，体现出典型布鲁氏菌基因组高度紧凑且连续性较好的特征。泛基因组分析显示，所分析菌株的总泛基因组包含3103个基因，其中3084个属于核心基因组，且不存在soft-core基因；附属基因组仅含23个shell基因，也未发现cloud基因。这说明这些菌株整体遗传结构高度保守，群体克隆性较强。进一步的菌株特异分析显示，BAQHM、BAHYS和BA0611分别携带14、15和16个附属基因，BAQHM中存在3个特有基因，提示在总体保守背景下仍存在有限的微小差异。
在“3.3. Predicted Virulence-Associated Genes and Antimicrobial Resistance Genes of B. abortus Strains”部分，研究人员对毒力与耐药相关基因进行了比对分析。结果表明，3株流产布鲁氏菌具有完全相同的毒力基因谱，共检出69个毒力相关基因，涵盖脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）生物合成、IV型分泌系统（type IV secretion system，T4SS）分泌效应因子、VirB分泌系统、Brucebactin铁载体合成以及bvrR/bvrS双组分调控系统等关键功能模块。值得注意的是，3株菌均一致缺失bmaA、btpB和virB10三个毒力相关基因，而其余关键毒力成分则保持完整。研究据此指出，这种“3基因一致缺失而其余毒力系统保守”的模式提示该地区存在一个克隆性较强、具有遗传区分度的流产布鲁氏菌谱系。耐药相关分析方面，3株菌均携带mprF基因，该基因与肽类抗生素抗性相关，可能通过促进赖氨酰磷脂酰甘油合成并改变细菌膜性质发挥作用。该结果说明这些菌株在耐受阳离子肽方面可能具有共同的遗传基础。
在“3.4. In Silico MLST and cgSNP Phylogenetic Analysis of B. abortus Strains”部分，研究人员进一步从分型和系统发育角度解析其群体关系。MLST结果显示，所有菌株具有完全一致的等位基因组合：gap（2）、aroA（1）、glk（2）、dnaK（2）、gyrB（1）、trpE（3）、cobQ（1）、int_hyp（1）和omp25（1），归属于序列型2（ST2）。该型别已知在亚洲与欧洲广泛分布，因此研究结果提示青海分离株与跨区域传播背景相吻合。cgSNP系统发育树显示，青海5株流产布鲁氏菌聚为同一大支，但可进一步分为两个亚支。研究中3株动物源菌株与2019年西藏牦牛源菌株及俄罗斯分离株亲缘关系较近；而QH5更接近宁夏和黑龙江菌株，QH22则与内蒙古、河北及俄罗斯菌株聚类。研究人员据此认为，青藏高原存在不同流产布鲁氏菌谱系的共循环现象。本研究所涉及的3株家畜源菌株之间遗传距离极近，支持其源于共同感染来源，并可归为聚集性感染。
讨论部分围绕流行病学意义、基因组特征与区域传播生态展开。研究人员指出，这是首次对青海3种宿主来源的流产布鲁氏菌进行系统分离和特征分析，不仅扩展了该菌在高海拔生态系统中的宿主范围，也揭示了此前未被充分认识的遗传多样性。结合当地既往血清流行病学和人群病例资料，研究强调布鲁氏菌病在畜牧业经济损失和公共卫生层面均构成持续负担。泛基因组结果所示的高度保守性、极少的附属基因以及无cloud基因的特征，支持这些分离株具有明显克隆性和基因组稳定性。研究还指出，全部菌株共同缺失bmaA、btpB和virB10，提示可能存在与地方宿主或高原环境相关的谱系特征。MLST与cgSNP结果进一步提示，青海高原并非仅存在单一来源的流产布鲁氏菌，而是存在多个相关但可区分的亚谱系，且可能与西藏、俄罗斯及中国其他地区菌株存在传播联系。研究据此强调，应将基因组监测与牲畜流动、放牧模式和野生动物生态信息相结合，以更好理解高原复杂生态系统中的布鲁氏菌传播。
研究同时指出若干局限性。首先，纳入菌株数量相对有限，影响结果外推性；其次，缺乏分离株表型药物敏感性数据，因而尚不能从药敏层面对区域治疗与防控提供更直接指导。尽管如此，本文仍为青藏高原流产布鲁氏菌的跨宿主传播与遗传结构提供了重要基础资料。
结论部分可译为：本研究首次对青藏高原家畜源流产布鲁氏菌（Brucella abortus）菌株进行了基因组学表征，揭示其为一个具有亚结构的克隆性群体，并与西藏、俄罗斯及中国其他地区菌株相关。这些结果增进了对高海拔生态系统中布鲁氏菌多样性及传播特征的认识，并为改进地方防控措施提供了遗传学依据。青海地区不同宿主及环境储存库中流产布鲁氏菌的并存，共同维持了区域性传播循环。应对这一挑战需要采取多层面的策略，包括扩大不同宿主与地区的病原分离范围，结合环境驱动因素分析菌株分布，并开展功能研究以评估特定基因缺失和耐药性状的影响。
