《RSC Pharmaceutics》：The interplay between cationic peptide sequence, siRNA and electrolyte: formulating lipopolyplexes in NaCl solution affords nanocomplexes with exceptional levels of gene silencing
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脂质多肽复合物（Lipopolyplexes, LPR）是siRNA治疗的重要非病毒载体。然而，许多已开发的制剂在生理相关条件（如含血清）下不稳定或细胞摄取较差。本研究考察了在NaCl溶液中配制三元LPR（由DOTMA:DOPE＝1:1阳离子脂质体、带有靶向序
脂质多肽复合物（Lipopolyplexes, LPR）是siRNA治疗的重要非病毒载体。然而，许多已开发的制剂在生理相关条件（如含血清）下不稳定或细胞摄取较差。本研究考察了在NaCl溶液中配制三元LPR（由DOTMA:DOPE＝1:1阳离子脂质体、带有靶向序列的单支链阳离子多肽及siRNA共同配制）对纳米复合物结构和基因沉默活性的影响。研究人员制备的LPR在含胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）的培养基中仍保持高水平基因沉默；当使用含His或His?Arg阳离子序列的多肽时活性尤为突出，优于Lipofectamine 2000对照。研究表明这些LPR为大尺寸多层囊泡（Multilamellar）复合物，可高效包封并保护siRNA；最有效His或His?Arg序列与siRNA的络合较松散。本研究为在生理相关条件下优化LPR配方以实现体内治疗性基因沉默提供了重要进展，为临床更有效且低毒的siRNA疗法奠定基础。
《RSC Pharmaceutics》刊载研究论文解读——在NaCl溶液中配制含组氨酸/精氨酸阳离子多肽的siRNA脂质多肽复合物（Lipopolyplex, LPR）提升血清条件下基因沉默效率
一、研究背景与立题依据
小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）是极具潜力的基因沉默治疗药物，首个siRNA脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle, LNP）药物Onpattro已于2018年获FDA批准。脂质多肽复合物（Lipopolyplex, LPR）作为三元非病毒载体（脂质L＋阳离子多肽/聚合物P＋siRNA R），较LNP具模块化灵活、热稳定性好、可表面展示靶向配体等优势。但目前多数LPR在生理离子强度及含血清条件下易聚集、解离或细胞摄取差；阳离子聚合物（如聚乙烯亚胺 Polyethyleneimine, PEI）虽siRNA结合强但毒性大、胞质释放慢。阳离子多肽生物相容、可降解、低毒，且序列可设计引入pH响应（组氨酸Histidine, His）或细胞穿透（精氨酸Arginine, Arg）功能。前期研究发现含混合Lys?His序列的LPR及在高离子强度（OptiMEM）中配制可提高血清稳定性，推测NaCl存在可优化LPR组装。本研究系统探究在NaCl溶液中配制含不同阳离子多肽序列（Lys/His/Arg及混合His?Arg、His?Lys、Arg?Lys）的LPR，对其理化结构、siRNA包封/保护/释放及含血清条件下基因沉默活性的影响。
二、主要关键技术方法
研究人员采用薄膜水化?超声法制备DOTMA:DOPE（1:1摩尔比）脂质体（无盐/Vw、含120?mM NaCl/Vs），先后加入单支链阳离子多肽（含furin可切连接子RVRR及靶向序列CYGLPHKFCG、阳离子区为Lys12、Arg12、His12、(HR)6、(HHR)4、(HK)6、(RK)6、K4）和荧光素酶靶向siRNA，固定脂质:多肽:siRNA电荷比0.5:12:1配制水相LPR（VwLPRw、VwLPRo）与盐水相LPR（VsLPRs）。以A549?Luc细胞为模型，在OptiMEM或无血清/含10% FBS的RPMI?1640中孵育，通过荧光素酶发光法检测基因沉默效率；琼脂糖凝胶阻滞实验评估siRNA复合、聚天冬氨酸（poly?L?aspartic acid, pAsp）诱导释放及RNase?A保护；PicoGreen荧光法定量游离siRNA比例表征络合紧密程度；动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）测表观水合粒径与ζ电位；小角中子散射（Small Angle Neutron Scattering, SANS）采用层状堆叠拟合法解析双分子层厚度、d?间距及层板数（lamellarity）。
三、研究结果
Design of branched peptides（分支多肽设计）
研究人员设计阳离子区含24个残基（Lys/His/Arg或混合序列）的单支链多肽，连有RVRR可酶切连接肽及靶向人气道上皮细胞的环肽Y(CYGLPHKFCG)，分为单纯残基类（Group?1：K12BLY、R12BLY、H12BLY、K4BLY）与混合残基类（Group?2：(HR)6BLY、(HHR)4BLY、(HK)6BLY、(RK)6BLY），用于比较序列对LPR性能的影响。
In vitro knockdown experiments（体外基因敲低实验）
在OptiMEM稀释条件下，各配方均有一定敲低；含His序列（H12BLY、(HHR)4BLY、(HR)6BLY）效果较好，Arg/Lys及(RK)6BLY较差。在含10% FBS的RPMI?1640中稀释时，水配制LPR（VwLPRw）几乎无敲低，水制脂质+OptiMEM配制（VwLPRo）中等敲低，而全程120?mM NaCl配制VsLPRs中H12BLY与(HR)6BLY配方敲低率＞80%，优于Lipofectamine?2000对照；其他混合His序列略有改善，Arg/Lys及(RK)6BLY无改善。表明高盐全配制与含His/His?Arg序列协同实现血清耐受的高效沉默。
Complexation, release and protection of siRNA（siRNA复合、释放与保护）
凝胶电泳显示VwLPRw与VsLPRs均能完全阻滞siRNA迁移（加pAsp后可释放siRNA条带），经RNase?A处理后加pAsp仍可见完整siRNA条带，提示siRNA被包封保护；因NaCl可能抑制RNase?A活性，无法单独归因于纳米颗粒保护，但证实siRNA未明显降解。
How do the cationic peptide sequence and electrolyte affect the complexation efficiency of siRNA within the lipopolyplexes?（阳离子多肽序列与电解质如何影响siRNA络合效率）
PicoGreen assay显示：水配制LPR中各序列siRNA基本被紧密络合（荧光＜20%），H12BLY随肽:siRNA比升高荧光略增。NaCl配制LPR中，高效敲低的H12BLY与(HR)6BLY在低盐肽比下呈较高相对荧光（～50%），暗示siRNA?多肽络合较松散；而低效敲低的R12BLY、K12BLY、(RK)6BLY显示强络合（荧光＜20%）。表明较松散的肽?siRNA相互作用有利于基因沉默。
What is the effect of peptide sequence and electrolyte on the size and structure of the lipopolyplexes?（多肽序列与电解质对LPR尺寸与结构的影响）
DLS结果表明：水配制LPR粒径40–70?nm，ζ电位＋30~＋42?mV；NaCl配制VsLPRs粒径显著增大（175–375?nm），ζ电位＋25~＋35?mV，多分散指数（Polydispersity Index, PDI）≈0.20–0.27，放置一周粒径增长较水配制明显，含H12BLY及Group?2肽的VsLPRs粒径增幅最小。SANS拟合显示：水介质LPR为单层囊泡（bilayer thickness ≈41–43??）；120?mM NaCl中LPR双分子层略薄（约薄2–3??），d?间距增大，层板数增加（多为3–5层 multilamellar），与前置脂质体趋势一致且不受多肽序列显著影响。说明NaCl诱导形成较大多层结构，为共性特征。
四、讨论总结与结论翻译
讨论指出，NaCl配制使LPR形成较大多层复合物并维持siRNA包封保护，此结构改变为所有VsLPRs共性；而仅含His或His?Arg序列的VsLPRs获卓越敲低，对应PicoGreen显示其肽?siRNA络合较松散，利于内吞后siRNA在胞质有效释放。His咪唑基pKa≈7.6具"质子海绵"效应促内体逃逸，Arg侧链形成双齿氢键，二者协同致适中亲和力便于 cargo解脱。NaCl主要调控层状组装，肽?siRNA相互作用主导胞内释放与沉默效率。
结论部分原文翻译：
本研究表明，在NaCl溶液中配制基于siRNA的脂质多肽复合物（LPR）可获得在含血清条件下具高度有效基因沉默作用的制剂。研究人员通过详细结构与生物物理表征证明此类VsLPRs为大尺寸多层复合物，能高效包封并保护siRNA。当配方中使用含His或His/Arg的阳离子多肽（H12BLY与(HR)6BLY）时获得尤其突出的结果——此类VsLPRs在血清中实现的基因敲低水平超越"行业标准"Lipofectamine对照。影响高活性水平的关键因素似乎是阳离子多肽与siRNA间较松散的络合。未来需阐明His与Arg侧链、NaCl及带负电siRNA磷酸骨架间的相互作用本质，并解释此排列特别有利于siRNA递送的原因，从而指导设计出可在生理相关条件下高效递送治疗性siRNA的LPR复合物，推动下一代低毒RNA疗法发展。
