《Advanced Healthcare Materials》：Packed Hydrogel Microfibers as Scaffolds Supporting Dynamic Cellular Behavior and Biomaterial Inks in 3D Printing
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基于颗粒的水凝胶因其独特的物理性质（包括整体屈服性和多孔性），已被用作可注射支架、挤出式生物打印的生物材料墨水以及3D细胞培养的允许系统。这些性质部分由颗粒间相互作用和空间组织所调控，但在基于球形水凝胶微颗粒（HMP）的系统中，设计这些性质的能力有限。在此，研
基于颗粒的水凝胶因其独特的物理性质（包括整体屈服性和多孔性），已被用作可注射支架、挤出式生物打印的生物材料墨水以及3D细胞培养的允许系统。这些性质部分由颗粒间相互作用和空间组织所调控，但在基于球形水凝胶微颗粒（HMP）的系统中，设计这些性质的能力有限。在此，研究人员构建了基于颗粒的水凝胶，其中每个颗粒均为经切割的一段独立的电纺水凝胶微纤维，长度为93 ± 51 μm，直径为1.6 ± 0.3 μm，呈现出独特的黏弹性质，使其在没有颗粒间交联（退火）的情况下仍能保持稳定。纤维的柔韧性和高长径比使得纤维之间能够发生相互作用，从而形成堆积水凝胶微纤维（PHM）材料，该材料具有机械鲁棒性，在受拉伸时能够伸长而不断裂，并在恒定应变下表现出组织模拟性的应力松弛。作为细胞培养支架，3D打印PHM细丝中剪切诱导的单个纤维排列为细胞提供拓扑线索，促进细胞排列。细胞在PHM内部三维空间中铺展，这是由于微纤维所呈现的允许性微环境所致。这项工作突出了基于纤维的颗粒系统作为动态和允许性支架以及可打印生物材料在组织工程和再生医学中的优势。
## 研究背景与问题
当前，基于颗粒的水凝胶作为生物材料已展现出广泛应用前景。这类材料由离散的水凝胶微颗粒（HMP）通过颗粒间接触力以及工程化的颗粒间相互作用组装而成，具有动态性和微孔性等固有特征，可用于可注射和可挤出材料以支持组织再生和生长中的细胞活动。然而，设计这类材料面临核心矛盾：增强流动性与构建稳定性之间存在张力——降低颗粒堆积密度虽能增加颗粒运动性和孔隙率，但同时会削弱稳定材料整体的颗粒间相互作用。虽然颗粒间交联（退火）可增强稳定性，但这会减少或消除颗粒流动性，且仍需颗粒-颗粒接触，限制了可设计的间隙空间和微孔性。此外，现有基于球形HMP的系统在调控微尺度特征方面能力有限。因此，亟需开发新型颗粒基水凝胶系统，在保持动态特性的同时实现更高的设计自由度和细胞响应性。
## 研究内容、结论与意义
研究人员开发了未经退火的堆积水凝胶微纤维（PHM）作为块体材料，旨在利用PHM系统中的纤维间相互作用形成稳定、微孔且具动态特性的材料，以用于生物打印和细胞响应性3D培养系统的设计。该研究取得以下主要结论：
**机械性能方面**，PHM由电纺甲基丙烯酸化透明质酸（MeHA）微纤维经切割、离心堆积而成，无需纤维间交联即可作为弹性固体稳定存在。材料表现出应变响应性固-液转变、高达2000%–2500%的延伸率，以及快速应力松弛特性（特征松弛时间约5–10秒），其黏弹性可通过纤维间交联程度进行调控。
**生物打印应用方面**，PHM材料具有剪切稀化特性，可稳定挤出并形成宏观结构，打印过程中剪切诱导的纤维排列为细胞提供拓扑取向线索。
**细胞培养方面**，PHM支架可促进细胞在二维表面的排列以及三维空间中的铺展与动态行为，为细胞-微环境相互作用研究及组织工程应用提供平台。该论文发表于《Advanced Healthcare Materials》，为设计具有动态生物物理特性的仿细胞外基质（ECM）材料提供了新策略。
## 关键技术方法
研究采用电纺丝技术制备MeHA微纤维，经紫外光交联稳定后，通过系列针管研磨切割成段；利用离心法堆积纤维悬液制备PHM，并通过添加不同体积培养基调控纤维体积分数（100%、90%、80%）。机械性能表征采用振荡剪切流变仪进行应变循环、振幅扫描及应力松弛测试，采用改进的细丝拉伸延伸流变仪（FiSER）评估材料延伸性。使用FELIX BIOprinter配合22G针头进行挤出式3D打印。细胞实验采用永生化小鼠成肌细胞C2C12（ATCC，传代6–7），通过AlexaFluor-488鬼笔环肽标记肌动蛋白、DAPI标记细胞核进行荧光成像，采用ImageJ进行纤维定向性及细胞形态定量分析。部分支架经紫外光二次交联实现纤维间退火以作对照。
## 研究结果
**2.1 堆积水凝胶微纤维支架的制备**
研究人员通过电纺丝制备MeHA微纤维，紫外光交联后立即水化，再经16G、18G、20G针管序列研磨切割，获得直径1.6 ± 0.3 μm、长度93 ± 51 μm的微纤维片段。离心堆积后，材料在静止状态下表现为固体。通过向完全堆积的材料（PHM-100）中添加培养基，制备了纤维体积分数为90%和80%的PHM-90和PHM-80，以增加纤维间流体含量和孔隙空间。
**2.2 PHM的机械表征**
通过振荡剪切流变学测试，所有稀释度的PHM均表现出应变响应性固-液转变特征。与基于球形颗粒的系统不同，高应变去除后储能模量恢复率降低至60%–70%，归因于流变过程中微纤维的重排。PHM-100的屈服应变达136%，显著高于其他颗粒基水凝胶系统；PHM-90和PHM-80的屈服应变降至56%和57%，但仍保持应变屈服行为。研究人员还验证了AHA、NorHA和PEG等不同聚合物骨架的PHM系统均具有类似流变行为，表明该方法的普适性。
**2.3 PHM支架延伸性评估**
采用改进的FiSER测试评估材料延伸性。所有PHM组的断裂应变均达2000%–2500%，PHM-100延伸性最高（~2500%）。正常力随纤维密度降低而减小，但各组延伸性无统计学差异，表明延伸性由纤维几何形状决定，而纤维间相互作用密度决定拉伸过程中的受力。
**2.4 PHM支架黏弹性与应力松弛表征**
时间扫描显示所有PHM配方在低应变下表现为类固体行为，储能模量约50–150 Pa，储能模量约为损耗模量的5倍。通过调控MeHA表面甲基丙烯酸酯转化为胺基的比例，实现了纤维间交联度的调控：PHM-100 High（<5%转化）储能模量显著增加，tan δ降至0.05；PHM-100 Low（~60%转化）tan δ为0.08；未交联PHM-100的tan δ为0.17。应力松弛测试显示，未交联PHM均表现出应力松弛响应，且随纤维浓度降低、孔隙率增加而松弛更快更显著；PHM-100 High因共价交联限制纤维运动而仅表现轻微松弛。所有组特征松弛时间约5–10秒。
**2.5 PHM生物材料墨水的挤出**
PHM材料表现出剪切稀化特性，适用于挤出式3D打印。PHM-100可从22G针头稳定挤出直径约0.5 mm的细丝，无需纤维间交联即可承受水平1 cm移动和垂直额外拉伸而不断裂。细丝可横跨2.5 × 2.5 cm方桌的四角支柱，保持圆柱形截面。荧光成像显示挤出过程中剪切诱导纤维沿打印方向排列，通过改变针头方向可实现正交取向的构筑。研究人员进一步打印了金字塔、立方体和管状等宏观结构，展示了材料的结构稳定性和形状保真度。
**2.6 PHM支架中的拓扑结构与动态纤维重排对2D和3D细胞培养的影响**
研究人员首先验证了挤出细丝的表面拓扑对细胞行为的影响。将含1 mM RGD的PHM-100打印后紫外交联稳定，接种C2C12细胞培养2天，鬼笔环肽染色显示细胞沿微纤维排列方向取向，证实微尺度拓扑提供接触引导。
随后研究了三维环境中纤维动态性对细胞行为的影响。将C2C12细胞包埋于未交联的PHM-100中，1天后细胞表现出广泛铺展，细胞形状指数（CSI）显示圆形度丧失，证实材料的允许性。长期培养实验中，将细胞包埋于随后交联或保持未交联的PHM-100中，7天内观察发现：交联组细胞始终保持球形，肌动蛋白面积从80增至160 μm2；未交联组细胞持续铺展并广泛相互作用，肌动蛋白面积从100增至430 μm2，各时间点均显著大于交联组。RGD的存在与否对三维环境中细胞铺展无显著影响。
## 讨论总结
PHM支架完全由小直径电纺纤维构成，能够呈现微尺度拓扑和接触引导线索。剪切诱导的纤维排列可用于调控细胞取向，而未交联PHM的动态允许性支持细胞三维铺展和多细胞相互作用，无需工程化材料降解。与直径为101–102 μm的球形微凝胶和水凝胶 strands 形成的其他颗粒基材料相比，PHM为细胞提供了直径约1 μm的小直径软微纤维颗粒可被细胞位移的物理环境。这种在细胞尺度上由细胞力量改变微环境的特性，在宏观尺度上表现为动态黏弹特性。PHM支架作为生物打印和工程化动态细胞微环境的平台具有潜力，其允许性设计拓展了现有连续水凝胶和颗粒基水凝胶的可设计性。
## 研究结论
堆积水凝胶微纤维作为生物材料具有广阔前景，其由单个纤维构成的微环境使细胞能够易于探查、重排和迁移。PHM支架仅由离散电纺微纤维构成，无需颗粒间交联即可形成稳定、具细胞指导性的生物材料。这些材料表现为弹性块体，在足够应变下可如液体般流动，高应变去除后恢复类固体行为。纤维的高长径比和长程相互作用赋予材料弹性响应、高延伸性（>2000%）及快速应力耗散能力（~10秒）。宏观挤出打印展示了丝状保真度和结构稳定性，即使无二次交联。剪切诱导的组分微纤维排列可用于指导接触打印细丝的细胞排列。包埋于材料内的细胞或潜在浸润细胞体验到允许性的三维环境，支持动态细胞相互作用。通过纤维分子设计、PHM制备和成型工艺以及生物打印等附加加工方式调控支架性质，有望支持为多种体外和体内应用设计类ECM和细胞指导性材料。与其他颗粒基和颗粒水凝胶系统类似，基于纤维的PHM支架提供了工程化水凝胶物理和化学性质的模块化途径，结合其生物物理特性，预计将成为研究细胞-微环境相互作用、形成微生理系统以及工程和再生组织的生物材料平台。
